[发明专利]用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法

权利要求书

1.用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，包括如下步骤：

（1）将成熟雄性小鼠断颈处死，把两侧附睾尾及输精管的精子冲出，-80℃保存备用；

（2）将（1）取得的精子在室温解冻后，在4℃、12,000g条件下离心10 min沉淀精子；

（3）将（2）获得的精子按照1. 5 ×10⁷个精子/mL Trizol液裂解，置于1.5ml Ep管中，用200μl枪头反复吹打沉淀至完全分散，然后在精子中首先加入20 μL β-巯基乙醇(β-ME) ， 65 ℃ 水浴60 min，然后加入0. 2 mL氯仿， 振荡20s， 28℃水浴锅中孵育5 min，12 000g、4℃ 离心15 min，得到分层的混合物，吸取分层混合物的下层500μl-700μl有机相转移至新管中，加入无水乙醇0. 3 mL， 4℃、12,000g 离心5 min， 使其中的DNA 沉淀；

（4）取（3）离心后的上清部分500μl-700μl转移至2mL新管中， 加入1.5mL异丙醇， 振荡30 s，在28℃ 水浴锅中孵育10 min， 12 000g、4 ℃ 离心10 min 沉淀蛋白，弃上清；加入2 mL 洗液，用200μl枪头反复吹打10次，洗涤蛋白沉淀，28℃水浴锅中孵育20 min，12 000 g、4 ℃ 离心5 min，弃上清，重复3 次；然后再用无水乙醇重复洗涤蛋白3 次，最后在室温下干燥10-20 min，待无水乙醇挥发殆尽为止；

（5）将（4）制备的精子蛋白沉淀溶于50μl-100 μl样品水化液中，加入400 μl丙酮，-20℃纯化15min，4℃、12,000g离心5 min，弃上清，再加入样品水化液50μl-100μl，在4 ℃ 下静止12 h，然后在4 ℃、12 000g离心10 min，弃不溶物，取上清，然后采用Bradford法对上清进行蛋白定量，重复3次，求平均值；

（6）根据（5）定量的蛋白浓度，计算出上样200μg-500μg所需的（5）中蛋白提取样品的体积，制备的蛋白提取样品和样品水化液加入聚焦盘中，使终体积在125μl-250μl之内，将胶条胶面朝下放入蛋白提取样品溶液，加盖矿物油3-5ml，充满整个胶条槽，室温下被动水化15小时后的胶条进行第一向等电聚焦电泳；

（7）经（6）处理后的胶条，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅰ，水平摇动15min，加入2.5ml平衡缓冲液Ⅱ，水平摇动15min，然后将胶条转移至12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的上端，琼脂糖封胶液封顶，加入封胶液去除气泡后，进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，条件是：15mA 30min，20 mA 100min；

（8）经（7）处理后的胶条用纯水洗3次，每次15min，然后用考马斯亮蓝染色液染色5h，再用超纯水脱色3次；

（9）将（8）制备的凝胶用图像扫描仪扫描，即得电泳图谱。

2.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的洗液为0.3 M 盐酸胍或95% 乙醇。

3.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的样品水化液是由下列原料的质量体积份（w/v）组成： 7 M 尿素、2 M 硫脲、4%CHAPS、65 mM DTT、0.2% （w/v）Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝，且均各种成分需现用现配。

4.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的第一向等电聚焦电泳包括下列步骤：无电压室温被动水化15小时，250伏电压线性除盐2小时，500伏电压快速除盐0.5小时，4000伏电压线性升压3小时，4000伏电压快速聚焦20000总电压时间积，500伏电压低压维持0到12小时。

5.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液Ⅰ由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、1%DTT配置而成。

6.根据权利要求1所述的用于双向电泳的小鼠精子总蛋白提取和分离方法，其特征在于，所述的平衡缓冲液Ⅱ由6 M 尿素、2%SDS、0.375M PH8.8 Tris-Hcl、20% 甘油、2.5%碘乙酰胺配置而成。