[发明专利]基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法

摘要

基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法。包括如下步骤：溶剂热法制备上转换纳米材料，采用反相微乳法对其进行氨基修饰，与氨基修饰的氯霉素适配子互补链偶联得到荧光信号探针。合成氨基化的磁性纳米材料，亲和素修饰后与生物素修饰的氯霉素适配子偶联得到捕获探针。两段互补链的杂交互补配对原则，两个探针形成一个可以用来检测氯霉素的纳米复合物。加入不同浓度的氯霉素后，氯霉素竞争性地与适配子结合，导致部分上转换纳米材料标记的互补链解离，在优化的实验条件下，氯霉素浓度和荧光强度分别在0.01-1ng/mL和1-10ng/mL范围内呈良好的线性关系，最低检测限可以达到0.01ng/mL。对牛奶的加标回收实验中，回收率在93.67%-101.41%范围内。

主权项

基于上转换荧光标记和磁分离技术的氯霉素检测新方法，其特征在于包括如下步骤：一步法制备氨基修饰的纳米材料Fe3O4：分别向圆底烧瓶中加入6.5 g 1, 6‑己二胺，30 mL乙二醇，1.0 g六水合三氯化铁和2.0 g无水醋酸钠，在油浴锅中50 ℃加热条件下搅拌形成均匀的胶体溶液；将所得溶液转移到 100 mL 带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，198℃条件下反应 6 h；反应结束后让反应釜自然冷却至室温，弃釜内上层液体，底部的黑色固体用去离子水冲洗至烧杯中，超声分散，然后磁分离收集；按照这个方式水洗2次，乙醇洗2次，所得黑色固体在 50 ℃条件下干燥；得到的即为氨基化 Fe3O4 磁性纳米颗粒固体粉末，储存备用；分别将Y(NO3)3·6H2O，Yb(NO3)3·6H2O，Er(NO3)3·6H2O配置成0.5 M，0.2 M，0.2 M的浓度保存备用；称取1.2 g NaOH溶于9 mL水中，然后加入10 mL乙醇，20 mL油酸，搅拌形成均质透明溶液，在磁力搅拌下向体系中面加入摩尔总量为0.6 mmol的稀土元素（摩尔比Y:Yb:Er = 78:20:2），随后向体系中逐滴加入NaF溶液（1.0 M，4 mL），搅拌约15 min，转移到50 mL容量带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，180 ℃的烘箱中反应8 h；称量1.6 g表面活性剂CO‑520溶于20 mL环己烷，搅拌一段时间后在磁力搅拌下加入已溶于环己烷（2 mL）中的上装换纳米材料，继续搅拌形成透明的反相微乳体系；然后向体系中加入200 μL的100 NH3·H2O，搅拌一段时间后加入100 μL的TEOS，20 μL的APTES，在室温下搅拌24 h；将5 mg的磁珠分散于5 mL的10 mM PBS中，超声分散，然后加入1.25 mL 25% 的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下孵育缓慢振荡 2 h；磁分离得到的磁性纳米材料用PBS清洗三次；再取1 mL（1.0 mg/mL的纳米材料）向里面加入100 μL亲和素（1.0 mg/mL），在室温下孵育缓慢振动12 h；称取10 mg上转换纳米材料分散于5 mL 10 mM的PBS（pH 7.4）中，超声15 min让其充分分散，然后加入1.25 mL 25% 的戊二醛溶液，将混合溶液在室温下摇床中孵育缓慢振荡2 h；通过离心分离得到上转换纳米材料，用10 mM PBS清洗三次；将得到的纳米材料重置于5 mL 10 mM PBS中，取1 mL（2.0 mg/mL的纳米材料）加入30 μL氨基修饰的氯霉素适配子互补链（10 μM），在室温下孵育缓慢振动12 h；反应结束之后离心，收集上清溶液，得到的固体用10 mM PBS清洗，然后将偶联好的材料溶于1 mL的STE缓冲液中，4 ℃条件下保存备用。