[发明专利]一种R‑3‑氨基丁醇的生产方法

摘要

一种R‑3‑氨基丁醇的生产方法，按照人工设计如SEQ ID NO1所示的序列进行全基因合成，将所合成的基因片段克隆入表达载体pET22b制备重组表达载体，将该载体转入大肠杆菌制备出重组D‑氨基酸脱氢酶的基因工程菌；对该菌进行培养制备重组D‑氨基酸脱氢酶；在反应溶液中依次加入终浓度为10‑300mmol/L的底物、质量百分浓度为2‑15%的助溶剂、终浓度为0.1‑1mmol/L的辅因子，终浓度为0.02‑1mol/L的氨基供体和质量百分浓度为0.01‑1%的D‑氨基酸脱氢酶组成反应体系进行反应；反应结束后提取反应液中的R‑3‑氨基丁醇；本发明成本低，转化率达到95%以上和产物得率大于85%，没有副产物，更适合工业应用。

主权项

一种R‑3‑氨基丁醇的生产方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：步骤一、重组D‑氨基酸脱氢酶基因工程菌的制备按照人工设计如SEQ ID NO：1所示的序列进行全基因合成；将所合成的基因克隆入表达载体pET22b的Nde I 和Hind III酶切位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D‑氨基酸脱氢酶的重组D‑氨基酸脱氢酶基因工程菌；步骤二、重组D‑氨基酸脱氢酶的制备将重组D‑氨基酸脱氢酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.6‑0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基‑β‑D‑半乳糖苷或终质量百分浓度为0.1%的D‑乳糖，置于25‑28℃继续培养20‑24h后，于4000rmp、4℃下离心收集菌体；采用pH值为7.5、100mmol/L的磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后将菌体重悬于含有终浓度为1mg/ml的溶菌酶以及6U的脱氧核糖核酸酶I的缓冲液中，置于30‑37℃消化1‑2h后再离心，获得上清液即为重组D‑氨基酸脱氢酶，检测其中的蛋白含量，备用；步骤三、R‑3‑氨基丁醇的制备在反应溶液中依次加入终浓度为10‑300mmol/L的底物、终质量百分浓度为2‑15%的助溶剂、终浓度为0.1‑1mmol/L的辅因子、终浓度为0.02‑1mol/L的氨基供体和终质量百分浓度为0.01‑1%的D‑氨基酸脱氢酶组成反应体系；将该反应体系在25‑30℃的条件下反应24‑26h；反应结束后，检测反应液中R‑3‑氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R‑3‑氨基丁醇，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R‑3‑氨基丁醇；所述底物为3‑羰基丁醇；所述的反应溶液为pH为7.0‑10.0的50‑100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH为7.0‑10.0的50‑100mmol/LTirs缓冲液或pH为7.0‑10.0的50‑100mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；所述的氨基供体为氯化铵。