[发明专利]一种R‑3‑氨基丁醇的生产方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物催化领域，涉及一种R-3-氨基丁醇的生产方法。 

背景技术

生物催化具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点 , 因此生物催化在新药的研究和开发中得到广泛的应用。此外 , 利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行改造优化，如提高催化剂的稳定性和底物选择性, 将使其能够更好地应用于生产工艺。 

R-3-氨基丁醇在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，结构式如下： 

  

目前用化学方法，在铵盐，镍的催化下可以合成消旋3-氨基丁醇（Chem.Abstr., 1947 , p. 6199），但尚没有用生物催化，尤其是用氨基酸脱氢酶合成的报道。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种R-3-氨基丁醇的生产方法，该方法与化学法相比，具有环境友好，光学选择性高等优点，原料成本低廉，操作简便，更适用于工业化大量生产。 

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是： 一种R-3-氨基丁醇的生产方法，其制备方法包括以下步骤： 

步骤一、重组D-氨基酸脱氢酶基因工程菌的制备

选择来源于Corynebacterium glutamicum ATCC13032的D-氨基酸脱氢酶基因序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET22b的Nde I 和Hind III酶切位点，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-氨基酸脱氢酶的重组D-氨基酸脱氢酶基因工程菌；

步骤二、重组D-氨基酸脱氢酶的制备

将重组D-氨基酸脱氢酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量百分浓度为0.1%的D-乳糖，置于25-28℃继续培养20-24h后，于4000rmp、4℃下离心收集菌体；采用pH值为7.5、100mmol/L的磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后将菌体重悬于含有终浓度为1mg/ml的溶菌酶以及6U的脱氧核糖核酸酶I的缓冲液中，置于30-37℃消化1-2h后再离心，获得上清液即为重组D-氨基酸脱氢酶，检测其中的蛋白含量，备用；步骤三、R-3-氨基丁醇的制备

在反应溶液中依次加入终浓度为10-300mmol/L的底物、终质量百分浓度为2-15%的助溶剂、终浓度为0.1-1mmol/L的辅因子，终浓度为0.02-1mol/L的氨基供体和终质量百分浓度为0.01-1%的D-氨基酸脱氢酶组成反应体系；将该反应体系在25-30℃的条件下反应24-26h；反应结束后，检测反应液中R-3-氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R-3-氨基丁醇，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基丁醇；反应体系的反应过程，取样采用高效液相进行检测样品中R-3-氨基丁醇的生成量，以监控其反应过程。

所述底物为3-羰基丁醇；所述底物为3-羰基丁醇；所述的反应溶液为pH为7.0-10.0的50-100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH为7.0-10.0的50-100mmol/LTirs缓冲液或pH为7.0-10.0的50-100mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；所述的氨基供体为氯化铵。 

有益效果是： 

本发明提供的R-3-氨基丁醇的生物制备方法，初始原料为3-羰基丁醇，价格便宜；所需的重组D-氨基酸脱氢酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，相对易得和廉价。所述反应为“一锅煮”式，底物和所有酶同时加入开始反应，直接得到终产物R-3-氨基丁醇，中间无需分离提纯。反应结束后，生成的氨、水、氧气易于除去，对产品的分离纯化没有干扰，水相体系中只剩下R-3-氨基丁醇，易于分离，有助于提高产品纯度和收率，降低分离成本。本发明工艺成本低，并且转化率达到95%以上，产物得率大于85%，并且没有副产物影响，该工艺方法更适合工业生产应用。

附图说明