[发明专利]桑树中期染色体的荧光原位杂交方法

摘要

本发明公开了桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，具体步骤为：先采用酶解去壁低渗火焰干燥法制备染色体玻片标本，该方法能够获得高质量的桑树染色体制片；然后制备5S rDNA和25S rDNA探针，该探针为重复序列，荧光信号强，易于检测，重复性高；最后进行染色体荧光原位杂交，获得桑树染色体形态完好，能够用于桑树染色体鉴定和结构研究，为桑树的进化研究等提供了新的途径。

主权项

桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)染色体玻片标本的制备：将桑树嫩叶于浓度为0.002M的8‑羟基喹啉水溶液中、25℃避光预处理3小时，用固定液固定后用水冲洗，然后将桑叶于1/15M的KCl溶液中、25℃低渗30～60分钟，低渗后用水冲洗，再将冲洗后的桑叶于含3‑5％(W/V)纤维素酶和3‑5％(W/V)果胶酶的混合酶液中、25℃酶解2‑5小时，用水冲洗后在水中处理10～120分钟；然后将材料磨成匀浆，加入固定液，静置5min弃沉淀，收集上层细胞悬液，将收集的细胞悬液再静置30min，收集下层细胞悬液，然后将细胞悬液滴在载玻片上，微微加热烤干，再将载玻片置于35‑40℃的烘箱中烘片30min‑120min，‑20℃保存备用；(2)5S rDNA和25S rDNA探针标记：分别以含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒为模板，分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物，采用PCR法合成地高辛或生物素标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针，分别得5S rDNA探针和25S rDNA探针；(3)染色体荧光原位杂交：将步骤(1)保存的染色体玻片标本在37℃条件下烘片2h，然后用RNase浓度为100μg/mL的2×SSC溶液在37℃温育1h，再用蛋白酶K浓度为1μg/mL的2×SSC溶液在37℃孵育15min，接着在37℃用2×SSC洗涤5min，在18‑25℃用2×SSC洗涤2次，每次5min；然后在72℃条件下用含70％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液变性10min，完毕在18‑25℃下依次用‑20℃预冷的体积分数为70％、90％和100％的无水乙醇各处理5min，晾干；然后向染色体玻片标本上加封阻液，并在37℃封阻15min，再用含5S rDNA探针或/和25S rDNA探针的变性杂交液加在封阻的染色体玻片标本上，盖片后在80℃共变性10min；然后在37℃孵育过夜，接着在37℃下用含10％(V/V)去离子甲酰胺的2×SSC溶液洗10s，在37℃下用2×SSC溶液洗涤2次，每次3min，再在18‑25℃下用含0.2％(V/V)吐温‑20的4×SSC溶液洗3min；然后在37℃下用1×封闭液封闭20min，再在染色体玻片标本上滴加荧光标记的抗地高辛或生物素的抗体，在37℃避光孵育1h，然后在37℃下，用含0.2％(V/V)吐温‑20的4×SSC溶液洗3min，再在18‑25℃下用含0.2％(V/V)吐温‑20的4×SSC溶液洗3min，接着在18‑25℃下用浓度为1μg/mL的DAPI避光复染5min，用2×SSC溶液清洗2min后在染色体制片上滴加抗荧光淬灭剂，盖片，封片，镜检。