[发明专利]桑树中期染色体的荧光原位杂交方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传学领域，具体涉及桑树中期染色体的荧光原位杂交方法。

背景技术

桑树(Morus alba L.)是桑科桑属植物，作为重要的经济林木，其叶片是家蚕的主要饲料。桑树已有七千多年的栽培历史，但常见的桑树多为通过扦插和嫁接繁殖的栽培种，遗传背景比较模糊，使得桑树在遗传育种和进化分析的研究中遇到很大的障碍。目前，桑树染色体常规核型分析已有报道，桑树拥有丰富的染色体倍数变化类型，例如川桑(M.notabilis)的染色体为14条，印度桑(M.indica)、白桑(M.alba)为28条，山桑(M.bombycis)是42条，而黑桑(M.nigra)存在308条染色体。但是利用吉姆萨染色形成的G带和C带分辨率有限，不能将所有染色体一一分开，特别是在二倍体的川桑中就有三对点状染色体，它们之间在形态上基本没有差异；在高倍体中，染色体形态更为接近，通常表现为点状，常规的染色体核型分析很难将它们区分。因此，高分辨率的核型分析技术有待开发。

荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybrization，FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，能够将与探针互补的DNA序列直观的定位到染色体上，并且寡拷贝的探针还能够锚定在单一的染色体上，为染色体的研究提供了很大的便利。目前，该方法已经广泛应用于遗传作图、转基因定位、染色体畸变检测、基因组结构和物种进化分析等方面。但是，在FISH染色体制片过程中，预处理，探针和抗体的浓度、探针和染色体共变性的温度和时间均影响实验结果，如预处理是否合适是染色体制片技术中最关键的操作步骤，决定着染色体长度是否适中，是否利于杂交；如果低渗和酶解不足或过度都会导致染色体制片的失败；而探针和抗体的浓度过高，容易导致洗脱不完全，导致非特异性杂交，出现假阳性；探针和染色体共变性的温度和时间也十分关键，如果共变性温度低或时间短，双链没有完全打开，不会杂交出特异信号，而共变性温度过高或时间过长都会导致染色体膨胀变形，不利于得到正常的实验结果。FISH技术已在很多植物上运用成功，但是，迄今为止在桑树中还未见荧光原位杂交技术应用的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，该方法简单，观察到桑树中期染色体的形态完好，信号强。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

桑树中期染色体的荧光原位杂交方法，包括如下步骤：

(1)染色体玻片标本的制备：将桑树嫩叶于浓度为0.002M的8-羟基喹啉水溶液中、25℃避光预处理3小时，用固定液固定后用水冲洗，然后将桑叶于1/15M的KCl溶液中、25℃低渗30～60分钟，低渗后用水冲洗，再将冲洗后的桑叶于含3-5％(W/V)纤维素酶和3-5％(W/V)果胶酶的混合酶液中、25℃酶解2-5小时，用水冲洗后在水中处理10～120分钟；然后将材料磨成匀浆，加入固定液，静置5min弃沉淀，收集上层细胞悬液，将收集的细胞悬液再静置30min，收集下层细胞悬液，然后将细胞悬液滴在载玻片上，加热烤干，再将载玻片置于35-40℃的烘箱中烘片30min-120min，-20℃保存备用；

(2)5S rDNA和25S rDNA探针标记：分别以含有SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重组质粒为模板，分别以SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4为引物，采用PCR法合成地高辛或生物素标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的探针，分别得5S rDNA探针和25S rDNA探针；