[发明专利]一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法

摘要

本发明公开一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，属于生物检测技术领域。包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察；将浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^‑1的烟曲霉放置于无菌玻璃细胞爬片，静置于35~37℃生化培养箱中培养，然后分别在培养的不同时间荧光染色，共聚焦显微镜下观察烟曲霉生物膜胞外多糖的变化。本发明提供的烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法实验操作简单、快速准确得出结果和重复性好。

主权项

一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，其特征在于：包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察，具体检测步骤如下：1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；2）收集菌株 将烟曲霉菌经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；3）制备烟曲霉生物膜载体 将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI‑1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI‑1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^‑1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中培养；4）荧光染色方法A：制备TRITC‑conA染液，将10~15mg TRITC‑conA和5~10ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液置于容器中，并不断搅拌至TRITC‑conA颗粒完全溶解，得TRITC‑conA染液，并用1.5~3ml避光离心管分装，每个离心管中装80~100μl TRITC‑conA染液，置于‑20~‑25℃保存；B：制备TRITC‑conA和FITC‑ECA混合染液，将步骤A制备的TRITC‑conA染液，加入1~3ml去离子水，后加入40~50μl FITC‑ECA染液，用漩涡振荡器震荡30~60s，再用离心机以2000~3000rpm转速离心2~4min；C：将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，去除浮游菌；D：将步骤B制备的TRITC‑conA和FITC‑ECA混合染液100~120μl滴加到载体上，并晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置90~100min；E：将步骤D制备的载体用磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液；5）共聚焦显微镜观察 用波长为488nm的激发光观察FITC‑ECA，用波长为543nm的激发光观察TRITC‑conA。