[发明专利]一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及以一种用TRITC-conA和FITC-ECA混合染液检测烟曲霉生物膜胞外多糖的方法。

背景技术

近年来随着恶性肿瘤、HIV、器官移植等患者增加，烟曲霉感染呈现出快速发展趋势，感染率仅次于白色念珠菌，成为免疫低下患者主要的死亡原因。烟曲霉导致的侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）死亡率达到30-100%，耐药是导致治疗失败的一个重要原因，一项临床研究检测了1385个IA患者的烟曲霉菌株，发现对唑类耐药的IA患者死亡率达88%，而敏感菌株感染者死亡率为48%。体内外研究发现烟曲霉能形成生物膜，其不但可以在植入的外源性生物材料如人工心脏瓣膜、静脉插管、导尿管等表面生成，还可以在肺部空洞和支气管上皮直接形成。生物膜状态的烟曲霉不仅能形成持续的感染源造成慢性感染，而且还能作为天然屏障抵御抗真菌药，逃避机体免疫，使烟曲霉的耐药性提高几十至几百倍。鉴于生物膜作为烟曲霉耐药的重要机制，国内外对烟曲霉生物膜的研究日益重视。

烟曲霉生物膜由胞外多糖、多元醇、蛋白质、黑色素等物质组成，其中胞外多糖占90%，是生物膜的重要组成部分，而胞外多糖又由不同的多糖成分组成。因为不同的多糖成分在生物膜中发挥不同的作用，所以了解生物膜各种成分在临床及实验研究中的发展变化对研究生物膜感染具有重要的意义，然而目前常用且得到公认的形态学观察方法扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)并不能显示烟曲霉生物膜的成分。利用荧光染色法将生物膜胞外多糖染色观察在细菌生物膜研究中已有运用，但所用方法仅仅能标记一种多糖，不能同时观察到各种多糖成分在数量及分布情况方面的不同，对进一步揭示生物膜中各种多糖的功能形成阻碍。另外，烟曲霉属于真菌，由于细菌和真菌特点不同，它们所形成的生物膜特性也不完全相同，荧光染色法能否运用于烟曲霉生物膜的胞外多糖染色亦未见报道。

发明内容

本发明以荧光染色法将烟曲霉生物膜的胞外多糖染色，利用不同的颜色的染液标识出多糖的具体成分，并且能显示出各种胞外多糖在烟曲霉生物膜生长过程中的分布情况及量的变化。本发明所使用的技术方案为：一种烟曲霉生物膜胞外多糖的检测方法，包括制备载体、收集菌株、制备烟曲霉生物膜载体、荧光染色方法和共聚焦显微镜观察，具体检测步骤如下：

1）制备载体 将直径为10~15 mm玻璃细胞爬片进行灭菌，作为载体；

2）收集菌株 将烟曲霉菌经过96孔板造膜，以结晶紫半定量法筛选出成膜能力最强的菌株，作为试验菌株；

3）制备烟曲霉生物膜载体  将步骤2）获得的菌株接种在马铃薯葡萄糖琼脂平皿上，置于35~37℃培养箱培养活化3~5天，用5~10ml含有吐温20的磷酸盐缓冲液冲洗平皿表面收集孢子，用20~25ml MOPS缓冲的RPMI-1640重悬孢子，用血细胞计数板调整孢子浓度，并用RPMI-1640液体培养液调整浓度为1~5×10⁵·孢子·ml^-1，将1~2ml孢子悬液加入步骤1）制备的玻璃细胞爬片上，玻璃细胞爬片置于无菌24孔板的孔内，每孔放一个，静置于35~37℃生化培养箱中培养，培养24h取出载体；

4）荧光染色方法  

A：制备TRITC-conA染液，将10~15mg TRITC-conA和5~10ml 0.1mol/l的NaHCO₃溶液置于容器中，并不断搅拌至TRITC-conA颗粒完全溶解，得TRITC-conA染液，并用1.5~3ml避光离心管分装，每个离心管中装80~100μl TRITC-conA染液，置于-20~-25℃冰箱保存；

B：制备TRITC-conA和FITC-ECA混合染液，将步骤A制备的TRITC-conA染液，加入1~3ml去离子水，后加入40~50μl FITC-ECA染液，用漩涡振荡器震荡30~60s，再用离心机以2000~3000rpm转速离心2~4min；

C：将步骤3）制备的烟曲霉生物膜载体用无菌磷酸盐缓冲液漂洗，去除浮游菌；

D：将步骤B制备的TRITC-conA和FITC-ECA混合染液100~120μl滴加到载体上，并轻轻晃动载体使染液均匀涂布，后在室温下避光静置90~100min；

E：将步骤D制备的载体用磷酸盐缓冲液漂洗，洗掉未粘附的多余的染液；