[发明专利]一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法

摘要

一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，检测最佳培养体系，得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案，发现培养基RPMI1640的培养效果要优于用培养基DMEM培养和当培养基含2.5％的鸡血清时，培养效果最优。

主权项

一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，其特征在于：分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线，检测最佳培养体系，具体步骤为：(1)HD11细胞的准备：取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶；(2)MTT溶液的制备：称取125mg MTT，放入小烧杯中，加25mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)，在磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22μm的过滤器过滤除菌，分装，4℃保存，两周内有效，二甲基亚砜(DMSO,使用分析纯产品)；(3)培养基，胎牛血清及鸡血清的准备：分别准备两种未添加任何血清的培养基——RPMI1640和DMEM，各50mL，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25mL；所述步骤(3)的具体步骤为：1)取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；2)收集细胞，用PBS清洗2‑3次，离心(1000rpm，5min)弃上清，分别用未加任何血清的RPMI1640和DMEM重悬备用；3)分别制备含不同鸡血清的两种培养基：A.RPMI1640a.RPMI1640+10％FBS+2.5％鸡血清+重悬细胞；b.RPMI1640+10％FBS+5％鸡血清+重悬细胞；c.RPMI1640+10％FBS+10％鸡血清+重悬细胞；d.RPMI1640+15％鸡血清+重悬细胞；B.DMEM；e.DMEM+10％FBS+2.5％鸡血清+重悬细胞；f.DMEM+10％FBS+5％鸡血清+重悬细胞；g.DMEM+10％FBS+10％鸡血清+重悬细胞；h.DMEM+15％鸡血清+重悬细胞；4)接种细胞：按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复；5)细胞培养：放入CO₂培养箱，在5％CO₂、37℃条件下，按设计的时间分别培养5小时、10小时、24小时、48小时；6)呈色：按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，37℃继续孵育4小时，终止培养，离心(1000r/min,15min)小心弃去孔内培养液，每孔加入150uL DMSO，振荡10min，使甲臜充分溶解；7)比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线；8)结果：RPMI1640培养基与DMEM培养基比较差异极显著；不同的培养时间之间比较差异不显著；用不同鸡血清浓度培养之间比较差异极显著，两种培养基与不同培养时间之间互作比较，差异不显著；不同培养基与不同鸡血清浓度之间互作比较，差异极显著；不同培养时间与不同鸡血清浓度之间互作比较差异不显著；三者互作，差异不显著；通过两种多重比较方法显示，不同鸡血清浓度培养时，血清浓度为2.5％与其他三种鸡血清浓度有极显著的差异；并得到培养鸡巨噬细胞HD11的最优培养基方案为：RPMI1640(Sigma公司)，10％新生牛血清补充(热灭活)，10.0mM HEPES，1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，2.0mM谷氨酰胺，100U·mL^‑1的青霉素100μg/ml链霉素，5×10^‑5M2‑巯基乙醇(pH值7.3)，2.5％鸡血清。