[发明专利]一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞培养领域具体涉及细胞培养技术。

背景技术

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。鸡HD11巨噬细胞属于悬浮细胞，该细胞的现有的培养体系：RPMI1640(Sigma公司)，10％新生牛血清补充(热灭活)，10.0mM HEPES，1.0mM丙酮酸钠，0.1mM非必需氨基酸，2.0mM谷氨酰胺，100U·mL-1的青霉素100μg/ml链霉素，5×10-5M2-巯基乙醇(pH值7.3)和5％的二氧化碳。培养瓶横放如培养箱时培养基的深度超过5mm，当培养瓶直立放置时，培养基高度超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。

鸡HD11巨噬细胞目前的培养体系存在细胞生长缓慢，增殖效率低以及转染效率低等问题，影响了巨噬细胞在相关科学研究中的应用，阻碍了家禽免疫研究进展。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明以鸡巨噬细胞(HD11细胞)为研究对象，改进培养体系，用RPMI1640和DMEM两种不同培养基培养，并分别添加不同比例胎牛血清和鸡血清，在不同培养期间比较HD11细胞培养效果，旨在建立一种新的培养方法。本发明采用的技术方案如下：

一种培养鸡HD11巨噬细胞的新方法，分别用RPMI1640和DMEM两种不同的培养基，添加不同比例的胎牛血清和鸡血清，分别培养5小时、10小时、24小时、48小时后，通过MTT比色试验，记录光吸收结果；最后以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线，检测最佳培养体系，具体步骤为：

(1)HD11细胞的准备：取生长状态良好，处于对数期生长的细胞两瓶；

(2)MTT溶液的制备：称取125mg MTT，放入小烧杯中，加25mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)，在磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22μm的过滤器过滤除菌，分装，4℃保存，两周内有效，二甲基亚砜(DMSO,使用分析纯产品)；

(3)培养基，胎牛血清及鸡血清的准备：分别准备两种未添加任何血清的 培养基——RPMI1640和DMEM，各50mL，预热；预热好的胎牛血清和鸡血清各25mL；

所述步骤(3)的具体步骤为：

1)取生长状态良好，出于对数期生长的两瓶HD11细胞，分别计数；

2)收集细胞，用PBS清洗2-3次，离心(1000rpm，5min)弃上清，分别用未加任何血清的RPMI1640和DMEM重悬备用；

3)分别制备含不同鸡血清的两种培养基：

A.RPMI1640

i.RPMI1640+10％FBS+2.5％鸡血清+重悬细胞；

j.RPMI1640+10％FBS+5％鸡血清+重悬细胞；

k.RPMI1640+10％FBS+10％鸡血清+重悬细胞；

l.RPMI1640+15％鸡血清+重悬细胞；

B.DMEM；

m.DMEM+10％FBS+2.5％鸡血清+重悬细胞；

n.DMEM+10％FBS+5％鸡血清+重悬细胞；

o.DMEM+10％FBS+10％鸡血清+重悬细胞；

p.DMEM+15％鸡血清+重悬细胞；

4)接种细胞：按以上体系，将细胞接种于96孔板中，且每个水平4个重复；

5)细胞培养：放入CO₂培养箱，在5％CO₂、37℃条件下，按设计的时间分别培养5小时、10小时、24小时、48小时；

6)呈色：按设计时间培养后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，37℃继续孵育4小时，终止培养，离心(1000r/min,15min)小心弃去孔内培养液，每孔加入150uL DMSO，振荡10min，使甲臜充分溶解；

7)比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线；