[发明专利]一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗的方法与应用

摘要

本发明提供了一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗方法，该方法包括以下步骤：(1)利用微囊化方法制备微囊化动物细胞；(2)在细胞培养系统中，接入该微囊化动物细胞进行培养；(3)在该细胞培养系统中接入病毒进行培养，收获病毒液，制备疫苗。采用微囊化技术进行动物细胞的培养，解决了细胞大规模连续放大的问题，还发现利用该培养的动物细胞来繁殖病毒，病毒含量较高，用此病毒液来制备病毒疫苗同样起到比较好的免疫效果。本发明还提供了一种哺乳动物细胞悬浮培养制备细胞表达产物的方法。本发明降低了对微载体的依赖，生产成本有较大的降低。

主权项

1.一种使用微囊化哺乳动物细胞制备疫苗的 方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）细胞准备：取对数生长期的PK15细胞、ST细胞、Marc145细胞、或BHK21细胞消化后，调整细胞密度分别为2×10⁶cell/ml、2×10⁶cell/ml、2×10⁶cell/ml、1×10⁶cell/ml作为包被用材料；（2）囊材溶液的配制：按照15g/L的终浓度比例将海藻酸钠加入超纯水，搅拌均匀后，115℃灭菌30min，备用；（3）水相混合液的配制：按照轻质CaCO₃和超纯水0.3g:2ml质量体积比搅拌均匀后，115℃灭菌30min后，取2ml，加入步骤（2）配制的无菌海藻酸钠溶液20 ml，混合均匀后，加入步骤（1）准备好的所述细胞种子液22ml，使所述PK15细胞、ST细胞、Marc145细胞、或BHK21细胞的终浓度分别为1×10⁶cell/ml、1×10⁶cell/ml、1×10⁶cell/ml、0.5×10⁶cell/ml，搅拌均匀后作为水相；（4）油相混合液的配制：按照1:1000的体积比将0.1份Span80加入100份液体石蜡中作为油相；（5）沉降剂的配制：配制浓度为0.2mol/L的CaCl₂溶液，115℃灭菌30min，2~8℃保存备用；（6）微胶囊的制备：在NBS Celligen310生物反应器中，在400rpm的搅拌速度下，按照水相与油相体积比为1:5的比例，向油相中缓慢加入水相，然后按照冰醋酸与油相的体积比为1:500的比例，按照0.5ml/min的流速加入冰醋酸，加入冰醋酸后搅拌10min，停止搅拌，再按照沉降剂与水相体积比为1:10的比例，按照5ml/min的流速加入沉降剂，待胶囊沉淀后，依次除去水相和油相，得包裹所述细胞的微胶囊；（7）微胶囊的洗涤：用灭菌PBS洗涤微胶囊2次，用含体积百分比浓度为1%血清的MEM洗涤1次后，即可用于包被后培养；（8）微胶囊大规模培养：将含有所述微囊化细胞的Celligen310细胞培养系统中，分别添加含体积百分比浓度为1%血清的MEM培养PK15细胞、ST细胞、或Marc145细胞、或无血清的MEM培养BHK21细胞，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器；（9）微胶囊接毒：微囊化细胞培养24h后，取微囊消化后计数，分别按照MOI=0.2在所述步骤（8）中所述1%血清的MEM中接入PCV2病毒、猪瘟病毒、或猪繁殖与呼吸综合征病毒、或按照MOI=0.1在所述步骤（8）中所述无血清的MEM中接入鸭坦布苏病毒，设定培养温度37℃，pH 7.4，溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，收获病毒液，制备疫苗。