[发明专利]一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗的方法与应用

说明书

本发明提供了一种哺乳动物细胞悬浮培养制备疫苗方法，该方法包括以下步骤：(1)利用微囊化方法制备微囊化动物细胞；(2)在细胞培养系统中，接入该微囊化动物细胞进行培养；(3)在该细胞培养系统中接入病毒进行培养，收获病毒液，制备疫苗。采用微囊化技术进行动物细胞的培养，解决了细胞大规模连续放大的问题，还发现利用该培养的动物细胞来繁殖病毒，病毒含量较高，用此病毒液来制备病毒疫苗同样起到比较好的免疫效果。本发明还提供了一种哺乳动物细胞悬浮培养制备细胞表达产物的方法。本发明降低了对微载体的依赖，生产成本有较大的降低。

技术领域

本发明属于生物制品领域。

背景技术

细胞培养中目前最令人振奋的进展之一是采用了微载体(Microcarr ier,MC)。最早由VanWezel所报道的这种载体,经马萨诸塞理工学院 (MIT)的研究小组广泛工作以后已得到改进,并扩充了应用范围。目前国际市场已有十几种商品MC出售。目前常用的商品化微载体有 cytodex系列、biosilon系列、solo微载体、Cultipher微载体和Fibra disk 片状载体等，这些微载体对用于细胞培养来说，价格往往过于昂贵，用于大规模生产成本大，不适合进行工业化生产。

微囊化技术主要用于病毒疫苗和化学药物的微胶囊化，通过微胶囊的缓释作用，从而提高受试动物的预防或治疗效果。微囊化培养在疫苗研制中的应用主要有以下几方面。

在口服型疫苗中的应用，利用微胶囊技术，把可口服的疫苗包裹住，制成耐酸碱可吸收的微胶囊。使用时通过饲料或饮水让动物摄入，经消化道吸收以后，壁材逐渐打开，芯材(疫苗)流出刺激动物产生免疫应答。微胶囊疫苗由于壁材的缓慢释放，疫苗对动物产生一个长期有效刺激，机体的免疫应答效果也会十分确实、稳定。利用这种技术用开发鱼类的缓释疫苗非常有意义。

在联苗中的应用，利用微胶囊技术，把两种疫苗微包处理后再混合制成联苗，由于不同疫苗壁材打开的时间各不相同，它所包含芯材(疫苗)释放出的时间也有先后之分，利用微胶囊技术生产的联苗，可以大大降低因同时免疫而产生的不同疫苗之间的拮抗作用，使机体对疫苗刺激产生一个合理的时间差，达到良好的免疫效果。

在基因工程疫苗研究中的应用：基因工程蛋白，在动物体内降解快，一次免疫很难起到很好的保护效果，可通过微囊化技术把蛋白进行微囊化，在不影响蛋白的抗原性的同时，还能延缓蛋白的免疫效果，已有文献报道微囊化乙肝表面蛋白疫苗后的免疫效果比传统工艺疫苗有较为明显的提升，使用一次注射就能实现比较好的免疫效果。

另外微胶囊化基因工程细胞，可用于制备高浓度的表达产物。微囊化培养杂交瘤细胞是一种大规模生产单克隆抗体的新技术,国外已应用于生产,其主要优点是单抗浓度高,纯度高,活力高,易于纯化。

在现有技术中未见有微囊化哺乳动物细胞生产病毒性疫苗的报道，主要是未解决大规模培养的瓶颈问题。专利申请CN101288836公开了利用一种微生物微胶囊大量制备的方法，并具体公开了：配制海藻酸钠溶液作为囊材，以氯化钙溶液作为固化剂，加入对数生长期的微生物种子液进行固化，并将包有微生物细胞的微胶囊接入发酵液中，培养至对数生长末期，过滤分离微胶囊获得产品的技术方案。然而，该技术方案使用高压空气和喷头的喷挤压雾法，存在有产品粒径过大的问题，且球形度和单分散性都很差，使得产品得率低，同时制备过程比较复杂，因此极大限制了其推广应用。

专利申请CN103614344公开了一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，具体公开了培养PK-15细胞液，在生物反应器内接种上述细胞液，加入片状微载体，进行细胞悬浮培养，所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型(PCV2)，接种 24小时后至240小时采用灌注工艺培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，冻融，得猪圆环病毒2型(PCV2) 病毒液。然而，该申请使用价格昂贵的片状载体，抗原生产成本较高；同时使用片状载体后，细胞从载体上消化解离解离困难，不能实现连续放大。