[发明专利]一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法

摘要

一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法，本发明方法针对不同的土壤样品利用玻璃珠研磨、液氮反复冻融、SDS和溶菌酶、蛋白酶K法等方法组合，使环境样品中的DNA充分释放暴露，通过多次酚仿抽提过程进行DNA的纯化，并且通过加入内标菌株Xcc8004的方式进行DNA提取效率的测定。本发明所述方法对于样品的预处理要求简单、所需的环境样品量较少，得到的DNA浓度和纯度较高，而且提取效率较高，能够满足复杂环境样本中抗生素抗性基因污染的分析检测，方法简单可靠，具有实际应用价值。

主权项

一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法，其特征在于步骤如下：第1、内标菌Xcc8004的培养；第1.1、内标菌Xcc8004培养基的配制；Xcc8004菌是一种革兰氏阴性菌，具有利福平抗性，该菌使用的培养基为NYG (Nutrient Yeast Glycerol）培养基；培养基的配方为：质量分数为0.5%的蛋白胨，质量分数为0.3%的酵母提取物，质量分数为2%的甘油，以及琼脂粉质量分数为1%的固体培养基，调节培养基的pH为7.0；利福平抗生素母液的配制浓度为10mg/ml，溶剂为甲醇，作用浓度为50μg/ml；第1.2、培养；    将Xcc8004菌接入到NYG液体培养基，置于28℃恒温振荡培养箱中振荡培养20h；第1.3、Xcc8004菌液浓度的确定；对第1.2步培养的Xcc8004菌采用涂布平板法或流式细胞仪法进行计数，确定菌液浓度；第2、土壤样品DNA提取；第2.1、微生物细胞裂解；将第1步培养的内标菌Xcc8004加入到0.5g土壤样品中混匀，其浓度为10⁸‑10⁹ CFU/g土壤，加入0.2g玻璃珠和1.5mL DNA提取液进行涡旋震荡至混匀，然后加入20µL 100mg/ml的溶菌酶，37℃水浴30分钟，中间轻晃离心管2次；其中，DNA提取液包括100mM Tris‑HCl、100mM Na₂EDTA、1.5M NaCl、1% β‑巯基乙醇、1×PBS Buffer、质量浓度为1%的PVP40000 (Polyvinyl pyrrolidone)和质量浓度为2%的CTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)； 将土壤样品进行冻融操作两次，具体为液氮中放置2分钟然后65℃水浴10分钟；再加入0.5mL质量浓度为20%的SDS溶液和10µL 20mg/mL的蛋白酶K，58℃水浴1h；取出离心管，6000×g离心10分钟，将上清液置于2mL无菌离心管中备用；第2.2、DNA溶液的获得；向第2.1步中分离得到的上清液中，加入15µL 20mg/ml的RNA酶，37℃水浴40分钟去除RNA，加入等体积的体积比为苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1的混合液，上下颠倒混匀进行抽提，4℃、13000×g离心10分钟，取上层液体置于新的无菌离心管中，重复此操作一次；再用体积比为氯仿：异戊醇=24:1的混合液抽提新获得的上层液体一次，4℃、13000×g离心10分钟，将上清液置于无菌离心管中；第2.3、粗DNA的纯化溶解；向第2.2步中得到的液体中加入0.1倍体积的3M NaAc溶液，混匀后再加入0.6倍体积的异丙醇，‑20℃时静置60分钟，13000×g离心10分钟，弃去上清液，用0.5mL 体积比为70%的冷乙醇洗涤沉淀，吹打使DNA浮起，10000×g离心2分钟，重复洗涤一次，弃去乙醇后风干沉淀30分钟，用30µL的65℃预热的TE缓冲液溶解DNA，TE缓冲液为pH=8.0的10mM Tris‑HCl和1mM EDTA的混合溶液；第3、内标基因的定量；利用实时荧光定量PCR检测提取的DNA中所含内标菌Xcc8004中的目的基因的拷贝数量。