[发明专利]一种从土壤样品中高效提取DNA的简易方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种环境样品特别是土壤样品中微生物DNA的简易提取方法，该方法借助生物技术手段，对环境土壤样品进行处理，属于环境科学与生物工程技术领域。

背景技术

抗生素抗性基因在自然环境中广泛的存在和传播扩散引起了巨大的环境和健康风险，有必要对自然环境中抗性基因的数量进行准确地检测。土壤介质是自然界微生物栖居较多的场所，目前已经在DNA分子水平上对土壤微生物的多样性和抗性基因的数量检测等方面进行了较多研究。土壤样品DNA提取过程主要包括细胞壁裂解、蛋白质和多糖去除以及DNA沉淀回收等环节。但是由于土壤基质复杂、干扰严重，如腐殖酸通过非特异性吸附降解核酸或抑制酶活性、干扰微生物细胞裂解，许多方法提取出来的DNA由于浓度和纯度不高而难以直接应用于后续分子生物学技术操作，如核酸内切酶酶切消化、PCR-DGGE、核酸分子杂交等。此外，在DNA的抽提过程中常常会残留蛋白质、腐殖酸等杂质，影响后续PCR定性和定量的检测分析，通常在用苯酚/氯仿/异戊醇抽提或过柱法去除杂质的过程中也会对核酸成分造成一定量的损失，因此DNA的提取效率也是准确地反映土壤中抗性基因数量的关键。

目前一些商业化的土壤DNA提取试剂盒对于不同类型的样品，其DNA的提取效率、浓度和纯度也往往有较大的差异，有些甚至无法满足后续各种分子生物学操作的要求。因此建立一种高效的土壤样品DNA提取方法至关重要。

本发明成果受国家环保公益专项基金（201309031）、国家自然科学基金（31270542）资助支持。

发明内容

本发明的目的是解决现有微生物DNA提取方法存在提取DNA量少、纯度不高、提取效率低，所用试剂价格昂贵等问题，而提出的一种高效提取DNA的简易方法。依据本发明方法可以计算DNA的提取效率，并且能得到可直接用于后续分子生物学操作的高纯度DNA。本发明关于提取效率的创新之处在于向未经灭菌的土壤样品中直接加入内标菌。

本发明提供的从土壤样品中高效提取DNA的简易方法，对于不同的土壤、粪便和水体沉积物样品均具有较好的DNA提取效果，并且该方法引入了DNA提取效率的指标，该指标是指通过在待提取的土壤样品中加入已知数量的内标细菌Xcc8004（Xanthomonas campestris pv. Campestris, Xcc8004，十字花科黑腐病菌，是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌），利用该菌基因组上的Xc2068基因的单拷贝的特点，提取DNA之后对该基因进行实时荧光定量PCR确定其拷贝数量，以此计算出DNA的提取效率。加入内标菌之前的土壤样品DNA经过PCR反应检测不到目的基因Xc2068的存在。

本发明方法的具体步骤为：

第1：内标菌Xcc8004的培养；

第1.1：内标菌Xcc8004培养基的配制；

内标菌Xcc8004是一种革兰氏阴性菌，具有利福平抗性。该菌使用的培养基为NYG（Nutrient Yeast Glycerol）培养基。培养基的配方为：质量分数为0.5%的蛋白胨，质量分数为0.3%的酵母提取物，质量分数为2%的甘油，以及琼脂粉质量分数为1%的固体培养基，调节培养基的pH为7.0。利福平抗生素母液的配制浓度为10mg/ml，溶剂为甲醇，其作用浓度为50μg/ml。

第1.2：培养；

将Xcc8004菌接入到NYG液体培养基，置于28℃恒温振荡培养箱中振荡培养20h；

第1.3、Xcc8004菌液浓度的确定；

对第1.2步培养的Xcc8004菌采用涂布平板法或流式细胞仪法进行计数，确定菌液浓度；

第1.3.1：涂布平板法计数

将培养20h的菌液进行10倍梯度稀释，稀释9个梯度。每个梯度浓度下的菌液取100μL涂利福平抗性的NYG固体培养基平板，每个浓度设置3个平行。

第1.3.2：流式细胞仪法计数

将培养20h的菌液用SYBR Green染料染色15分钟，稀释20000倍，取1mL样品进样，调节进样流速，读取细菌数量。

第2：土壤样品DNA提取；

第2.1：土壤样品微生物细胞裂解；