[发明专利]一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括制备葡萄座腔菌的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；将农杆菌与原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；确认潜在转化子基因组中是否含有目的基因，从而获得遗传稳定转化子。本发明以原生质体为转化材料，利用农杆菌介导将目的基因转入葡萄座腔菌内，并整合到基因组中。并且原生质体在共培养前，需要进行恢复培养，当恢复培养时间为2～6h时，每管转化材料可获得20～30个潜在转化子，当恢复培养时间超过6h或低于2h，转化效率迅速下降，只能获得少数潜在转化子甚至难以得到潜在转化子。

主权项

一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括以下步骤：(1)制备葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；(2)将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；(3)将步骤(2)得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤(1)中恢复培养后的原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；(4)确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子；所述恢复培养的条件为：在25～28℃下恢复培养2～6h；所述农杆菌为AGL‑1；步骤(2)中，利用冻融法将质粒载体转化到农杆菌中；步骤(3)中，农杆菌与原生质体的混合比例为：OD600为0.5～0.6的农杆菌100μL与浓度为2×106～4×106cfu/mL的原生质体200μL混合；所述诱导平板中含有0.2mM的乙酰丁香酮；所述共培养的条件为：22℃下共培养45～48h；诱导平板的表面覆盖有一层硝酸纤维素膜，农杆菌与原生质体的混合物是涂布到该硝酸纤维素膜表面上的；共培养完成后，将硝酸纤维素膜切成0.5cm宽的条带，并将各条带转移至筛选平板上，涂布有混合物的一面朝下，条带之间间隔0.5cm，置于28℃下培养7天；步骤(4)中，先将潜在转化子接种至无筛选压的培养基上培养，传代若干次后再转接至含筛选压的培养基上培养，能够正常生长的潜在转化子即为遗传稳定的转化子；通过PCR扩增检测潜在转化子的基因组DNA中是否含有外源目的基因。