[发明专利]一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法。

背景技术

葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是一种常见的全球分布的重要真菌，具有重要的开发利用价值。这类真菌有的可以腐生在各种腐木上，有的在多种木本植物上寄生，引起木本植物的病害，有的与植物形成共生体，是许多植物的内生真菌。在腐木上营腐生生活的葡萄座腔菌可以将木本植物残体分解，在生态系统的物质循环和能量循环中具有重要作用；同时，这类真菌还可以被开发以生产木质素酶和纤维素酶，具有很好的经济开发前景。而属于内生真菌的菌株可以作为生物反应器，如从北非雪松中分离的一株真菌可以产生15种新的化合物，其中有3种具有抗病原真菌、抗氧化功能。

作为植物病原菌的葡萄座腔菌菌株也有开发价值，是重要的待开发生物资源。植物病原菌要成功侵染寄主植物，就必须能够克服植物的防卫反应，还要能够穿过植物表皮等植物的物理保护屏障。因此，植物病原菌往往能够产生比腐生菌更多的胞外降解酶和其他效应子，使植物的防卫反应下降，并将植物表皮细胞壁成分进行必要的降解。

一些真菌的基因组序列分析结果也表明，与腐生真菌相比，植物病原真菌的基因组中含有更多的细胞壁降解酶基因，而内生真菌的基因组中含有的细胞壁降解酶基因最少。因此，植物病原菌可以开发成生产胞壁降解酶类的生物资源，如降解作物秸秆或林木残体，在环境保护、生物质能源开发方面具有很好的应用前景。作为植物病原菌的葡萄座腔菌菌株还可以用于生物转化生产特定的功能化合物，如诺卡酮(Nootkatone)是重要的工业原料，葡萄座腔菌可以将巴伦西亚橘烯转化为诺卡酮Nootkatone，在减肥产品、增强免疫力的保健产品和美容产品。

随着现代生物技术的发展，分子生物学技术已经与传统生物学技术结合在一起，大大促进了生物学研究和生物产业的发展，无论是对生物细胞进行分子改造，还是克隆有用的基因，都需要建立外源基因转化进入细胞的转化体系，这是对细胞进行分子改造和研究的前提。针对葡萄座腔菌这种具有重要经济意义的真菌，截止目前，我们还没有见到如何针对该菌进行基因转化的报道。

发明内容

本发明提供了一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，首次建立了针对葡萄座腔菌的基因转化体系。

一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括以下步骤：

(1)制备葡萄座腔菌的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；

(2)将含有目的基因的质粒载体转化到农杆菌中；

(3)将步骤(2)得到的含有质粒载体的农杆菌与步骤(1)中恢复培养后的原生质体混合，于诱导平板上共培养后转移到筛选平板上培养，获得潜在转化子；

(4)确认潜在转化子的基因组中是否含有所述目的基因，从而获得遗传稳定的转化子。

本发明以原生质体作为转化材料，利用农杆菌介导技术将外源目的基因转入葡萄座腔菌的细胞内，并整合到葡萄座腔菌的基因组中。如未作特殊说明，本发明所述潜在转化子是指，能在筛选平板上生长但未确定目的基因是否稳定存在于其基因组的转化子。

并且，本发明的原生质体在共培养前，需要进行恢复培养，保证原生质体再生率，从而提高获得稳定遗传转化子的几率。试验发现，若原生质体未进行恢复培养即与农杆菌共培养，或者直接采用菌丝作为转化材料，则几乎难以获得潜在转化子。

具体地，一种农杆菌介导的葡萄座腔菌基因转化方法，包括以下步骤：

(1)制备葡萄座腔菌的原生质体，并对原生质体进行恢复培养；葡萄座腔菌原生质体的制备方法可参见文献(高静，李艳波，柯希望，康振生，黄丽丽.PEG介导的苹果腐烂病菌原生质体转化.微生物学报，2011，51(9):1194～1199)中公开的相关内容，本发明的原生质体制备方法在该公开内容的基础上稍作调整，将文献中的“酶解液浓度50mg/mL Driselase+10mg/mL Lysing Enzymes情况下，按10mL酶液/0.5g湿菌体比例，酶解2h”改为：“酶解液浓度10mg/mL Driselase+10mg/mL Lysing Enzymes情况下，按10mL酶液1g湿菌体比例，28℃酶解3h”。