[发明专利]一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法

摘要

本发明涉及一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，步骤a，制作PLC内核；步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架；步骤c，制作PGA/PLA复合耳支架；步骤d，软骨细胞培养；步骤e，耳廓支架构建软骨；步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植，将软骨细胞-耳支架复合物体外培养1周后分别进行裸鼠皮下植入。本发明应用带PCL内核材料可以构建组织工程软骨，具有足够的强度对抗植入皮下所带来的张力从而维持原先复杂精确的形状。

主权项

一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，该具体过程为：步骤a，制作PLC内核；PCL内核是PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术制成的网格状多孔支架，将网格状的PCL裁剪成适合大小，置于耳廓模具中加压固定，加热加压，待加压过程中冷却至室温后，取出成耳廓型的PCL内核，修剪多余材料；步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架；步骤b1，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，将PGA无纺棉均匀的铺在专用的长方形盒中，制作成长方形的小片，每片约150mg，共需2片；步骤b2，将上述小片置于耳廓模具中并用无水乙醇浸饱，加压固定，待无水乙醇挥发后，耳廓形态初步稳定；步骤b3，滴加0.3％‑3％的PLA二氯甲烷溶液，并于模具内继续加压塑形，每次滴加PLA溶液前先称重，待材料约为158‑165mg时即不再滴加PLA溶液，最后得到两片耳廓形态PGA/PLA复合支架；步骤b4，将上述耳廓形态网格状PCL叠加于上述两片耳廓形态PGA支架间，置于耳廓模具中加压固定，加热加压冷却，使微融的PCL与上下两层PGA/PLA复合支架紧密粘合；步骤b5，取出制备好的带内核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3％‑3％的PLA二氯甲烷溶液后于模具中加压塑形，最终形成具有逼真耳廓形态的带内核支架；步骤c，制作PGA/PLA复合耳支架；与上述步骤b相同，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，制作成长方形的小片，每片约300mg，滴加1％PLA，待材料约为330mg时即制备完成，修剪为耳廓形状备用；步骤d，软骨细胞培养；步骤d1，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，加入3倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于37℃恒温水浴振荡器消化30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，沉淀细胞，除去胰蛋白酶；步骤d2，加入0.15％II型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，立即使用，置于37℃恒温水浴振荡器内消化6～8h；步骤d3，直至大部分软骨块被消化后，获得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10％胎牛血清和1％三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬，所得细胞以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力，在倒置显微镜下血细胞计数器计数后调整细胞密度至1x10⁴/cm²的浓度接种在100mm培养皿上，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70％‑80％融合时进行传代；步骤e，耳廓支架构建软骨；将耳廓支架用75％乙醇消毒后，PBS冲洗3次，软骨细胞培养液冲洗3次后将支架置于培养液中预培养；将第一代(P1)兔耳软骨细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，用含10％FBS和1％三抗的DMEM培养液重悬至浓度100×10⁶/ml，等量均匀的接种在两组支架材料上；步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植，将软骨细胞‑耳支架复合物体外培养1周后分别进行裸鼠皮下植入。