[发明专利]一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法

权利要求书

1.一种应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，该具体过程为：

步骤a，制作PLC内核；PCL内核是PCL颗粒材料以热熔融沉积快速成型技术制成的网格状多孔支架，将网格状的PCL裁剪成适合大小，置于耳廓模具中加压固定，加热加压，待加压过程中冷却至室温后，取出成耳廓型的PCL内核，修剪多余材料；

步骤b，制作带PCL内核PGA/PLA复合耳支架；

步骤b1，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，将PGA无纺棉均匀的铺在专用的长方形盒中，制作成长方形的小片，每片约150mg，共需2片；

步骤b2，将上述小片置于耳廓模具中并用无水乙醇浸饱，加压固定，待无水乙醇挥发后，耳廓形态初步稳定；

步骤b3，滴加0.3％-3％的PLA二氯甲烷溶液，并于模具内继续加压塑形，每次滴加PLA溶液前先称重，待材料约为158-165mg时即不再滴加PLA溶液，最后得到两片耳廓形态PGA/PLA复合支架；

步骤b4，将上述耳廓形态网格状PCL叠加于上述两片耳廓形态PGA支架间，置于耳廓模具中加压固定，加热加压冷却，使微融的PCL与上下两层PGA/PLA复合支架紧密粘合；

步骤b5，取出制备好的带内核支架，修剪多余的材料，再滴加一次0.3％-3％的PLA二氯甲烷溶液后于模具中加压塑形，最终形成具有逼真耳廓形态的带内核支架；

步骤c，制作PGA/PLA复合耳支架；

与上述步骤b相同，将长纤维撕开制成单股PGA无纺棉，制作成长方形的小片，每片约300mg，滴加1％PLA，待材料约为330mg时即制备完成，修剪为耳廓形状备用；

步骤d，软骨细胞培养；

步骤d1，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，加入3倍体积的0.25％胰蛋白酶，置于37℃恒温水浴振荡器消化30min，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，沉淀细胞，除去胰蛋白酶；

步骤d2，加入0.15％II型胶原酶，以软骨细胞培养液配成相应浓度，0.22微米针式滤器过滤，立即使用，置于37℃恒温水浴振荡器内消化6～8h；

步骤d3，直至大部分软骨块被消化后，获得的消化液用100微米细胞滤网过滤，1500r/min，离心5min，沉淀的细胞用含10％胎牛血清和1％三抗的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基重悬，所得细胞以台盼蓝染色计数，并检查软骨细胞活力，在倒置显微镜下血细胞计数器计数后调整细胞密度至1x10⁴/cm²的浓度接种在100mm培养皿上，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养扩增，待软骨细胞生长至70％-80％融合时进行传代；

步骤e，耳廓支架构建软骨；

将耳廓支架用75％乙醇消毒后，PBS冲洗3次，软骨细胞培养液冲洗3次后将支架置于培养液中预培养；将第一代(P1)兔耳软骨细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集，用含10％FBS和1％三抗的DMEM培养液重悬至浓度100×10⁶/ml，等量均匀的接种在两组支架材料上；

步骤f，体外构建耳廓的裸鼠皮下回植，将软骨细胞-耳支架复合物体外培养1周后分别进行裸鼠皮下植入。

2.根据权利要求1所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤f中，植入时采用水合氯醛腹腔注射麻醉裸鼠，在臀部横向切开皮肤约2cm，用眼科弯剪在皮下向头侧分离出腔隙；将细胞材料复合物用PBS漂洗3遍以去除血清成分，小拉钩暴露分离开的腔隙，眼科镊轻轻夹持组织边缘，将组织送入到皮下间隙内，耳支架凹陷面贴靠皮肤，固定好位置，以5-0尼龙线缝合切口；以1mm注射器由皮肤刺入，抽吸空气，使皮肤和肉膜紧贴细胞材料复合物，8周后取材。

3.根据权利要求1或2所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤e中，将软骨细胞等量均匀的接种在两组支架材料上，在37℃，5％CO₂，饱和湿度条件下培养4小时后，加入软骨细胞培养液，即10％胎牛血清，1％三抗的DMEM培养基，继续培养，隔天换液。

4.根据权利要求3所述的应用带PCL内核材料构建组织工程软骨的方法，其特征在于，在上述步骤d1中，无菌条件下切取新西兰大白兔单侧耳廓软骨，仔细剥离表面的软骨膜，剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，氯霉素冲洗液冲洗3遍。