[发明专利]石墨烯－CpG制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种石墨烯－CpG制备方法，其特征在于具体步骤如下：首先功能化石墨烯（Graphene），称量1mgGraphene和5mgPL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸馏水，置于摇床摇动至DSPE-PEG完全溶解；室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液；记录所获得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光谱；Graphene终浓度正常范围是40～70mg/L，4°C保存；再将石墨烯与寡核苷酸CpG结合；其制备方法独特，可明显抑制乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的生长，比较PBS组差异显著，肿瘤体生长明显受到抑制，具有统计学意义。

主权项

1.一种石墨烯－CpG制备方法，其特征在于具体步骤如下：（一）首先功能化石墨烯（Graphene）1）称量1mgGraphene和5mgPL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸馏水，置于摇床摇动至DSPE-PEG完全溶解；2）置于VrtisVirSonic300S水浴超声机中超声处理60分钟，每间隔5～10分钟输出功率调到7级，然后每次去水加冰至水浴箱中，避免过热；3）室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液；4）记录所获得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光谱；Graphene终浓度正常范围是40～70mg/L，4°C保存；5）从第3步骤制备的原液中取出1ml放入具有100kDa分子量筛截（MWCO）作用的4ml的Aicon离心过滤装置中，加入3ml蒸馏水，室温，离心10min，转速3000g，滤器中的残留物体积应该小于0.5ml，加蒸馏水至4ml，离心，重复加水，离心，共3次，以保证完全去除Graphene溶液中多余的PL-PEG，最后一步清洗完毕后，应用UV–VIS–NIR分光光度仪（重量消光系数是808nm，0.0465lmg¹cm¹）检测Graphene溶液浓度，加入蒸馏水调整Graphene浓度至100mg/L备用；（二）再将石墨烯与寡核苷酸CpG结合6）应用1mgSulfo-LC-SPDP磺基丁二酸亚胺基丙酸酯混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene50μlg/500μl，加入50ul10×PBS，室温下孵育2h；7）第6步开始后，立即制备10mMDTT溶液（1.54mgDTT+1ml蒸馏水），15μlDTT溶液制成100μMCpG100μl，室温下，反应1.5h；8）第6步后，应用Amicon超过滤器离心设备，截留分子量MWCO=100kDa去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP；加入4mlDNase/RNase-free水，离心10min，转速3000g，清洗3次，滤器中的残留体积应该小于0.5ml；9）第7步后，与第8步同时进行，应用NAP-5columnSephadexG-25DNAGrade（甲氧萘丙酸,2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸）葡聚糖柱蛋白凝胶分离）（GEHealthcare,17-0853-01）纯化CpG处理的DTT；应用500μlDNase/RNasefree1×PBS洗涤柱中的CpG，保存10～20μlDNA样品；10）应用第9步中的纯化的CpG500μl重悬第8步中活性Graphene；结合过程在4°C下持续24h；Graphene和CpG的终浓度分别是40mgl¹and5μg/μl；11）过滤活性Graphene溶液3次，收集每次过滤的上清液测量OD值；通过底物总上清（总共3次）计算第9步中的CpG终浓度，CpG终浓度＝第9步－第11步。