[发明专利]石墨烯－CpG制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种石墨烯－CpG制备方法及应用，用于医药领域。

背景技术

石墨烯在生物医药领域的应用面临着引起炎症反应的缺点。CpG寡核苷酸片段是最早于细菌中发现的能有激发免疫系统的杀伤作用的识别分子。目前，常被用于免疫治疗或免疫辅助治疗中。TLR-9是CpG发挥作用的胞内信号分子。但是人工合成的CpG寡核苷酸通常难以进入细胞，如何寻找稳定、高活性和生物相容性好的载运体系是CpG药物应用的关键。石墨烯或者CpG的单独应用，稳定性差，细胞摄取效率低。使得二者的生物治疗应用明显受到限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石墨烯－CpG制备方法及应用，其制备方法独特，可明显抑制乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的生长，比较PBS组差异显著，肿瘤体生长明显受到抑制，具有统计学意义。

本发明的技术方案是这样实现的：一种石墨烯－CpG制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（一）首先功能化石墨烯（Graphene）

1） 称量1mgGraphene和5mg PL-PEG5000-Amine（生物素－聚乙二醇）或者PL-PEG2000-Amine加入20ml直筒型厚壁玻璃管，加入5ml蒸馏水，置于摇床摇动至DSPE-PEG完全溶解；

2）置于Vrtis VirSonic 300S水浴超声机中超声处理60分钟，每间隔5～10分钟输出功率调到7级，然后每次去水加冰至水浴箱中，避免过热；

3）室温下，离心Graphene悬浮液3h，转速24000g，收集上清液；

4）记录所获得的Graphene溶液UV-VIS-NIR吸收光谱；Graphene终浓度正常范围是40～70mg/L，4°C保存；

5）从第3步骤制备的原液中取出1ml放入具有100kDa分子量筛截（MWCO）作用的4ml的Aicon离心过滤装置中，加入3ml蒸馏水，室温，离心10min，转速3000g，滤器中的残留物体积应该小于0.5ml，加蒸馏水至4ml，离心，重复加水，离心，共3次，以保证完全去除Graphene溶液中多余的PL-PEG，最后一步清洗完毕后，应用UV–VIS–NIR分光光度仪（重量消光系数是808nm，0.0465 l mg^?1 cm^?1）检测Graphene溶液浓度，加入蒸馏水调整Graphene浓度至100mg/L备用；

（二）再将石墨烯与寡核苷酸CpG结合

6）应用1mg Sulfo-LC-SPDP（磺基丁二酸亚胺基丙酸酯）混合第5步中的PL-PEG2000-amine功能化的Graphene 50μlg/500μl，加入50ul 10×PBS，室温下孵育2h；

7） 第6步开始后，立即制备10mM DTT溶液（1.54mgDTT+1ml蒸馏水），15μl DTT溶液制成100μM CpG 100μl，室温下，反应1.5h；

8）第6步后，应用Amicon（超过滤器）离心设备（截留分子量MWCO = 100 kDa）去除Graphene溶液中多余的Sulfo-LC-SPDP；加入4ml DNase/RNase-free水，离心10min，转速3000g，清洗3次，滤器中的残留体积应该小于0.5ml；

9）第7步后，与第8步同时进行，应用NAP-5 column Sephadex G-25 DNA Grade （甲氧萘丙酸,2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸）葡聚糖柱蛋白凝胶分离）（GE Healthcare, 17-0853-01）纯化CpG处理的DTT；应用500 μl DNase/RNase free 1 × PBS洗涤柱中的CpG，保存10～20 μl DNA样品；

10）应用第9步中的纯化的CpG 500 μl重悬第8步中活性Graphene；结合过程在4 °C下持续24h；Graphene和CpG的终浓度分别是40 mg l^?1 and 5μg/μl；

11）过滤活性Graphene溶液3次，收集每次过滤的上清液测量OD值；通过底物总上清（总共3次）计算第9步中的CpG终浓度 ，CpG终浓度＝第9步－第11步；

石墨烯－CpG用于治疗乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的药物应用。