[发明专利]一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-8测试方法

摘要

一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-8测试方法，包括以下步骤：1）配制实验试剂；2）细胞接种；3）电子烟烟液体染毒；4）WST-8染色；5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：在整个试验过程中减少了多次洗涤细胞的试验步骤，操作更为简便；WST-8染色时无需进行更换培养液的步骤，可直接加入稀释培养液进行反应；WST-8产生的甲臜是水溶性的，省去了后续的溶解步骤，染色后1.5-2h内即可完成吸光值检测，测试周期短，方便快速。由于WST-8对细胞无毒性，本测定方法具有对细胞无损、检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。

主权项

 一种电子烟烟液体外细胞毒性WST‑8测试方法，其特征在于：包括以下步骤： 1） 溶液制备：（1）细胞培养基：溶剂为RPMI‑1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L‑谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；（2）电子烟烟液染毒溶液：用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到；（3）WST‑8染液： 4 ℃保存；（4）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），200μg/ml，100%细胞致死率浓度；2）细胞样本处理：（1）细胞接种：本专利选择贴壁细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞CHO,人肺癌细胞A549和人肺正常上皮细胞BEAS‑2B细胞，由于不同细胞系的增殖速率不同，需根据实验所用细胞种类对细胞接种密度进行优化，然后向96孔板（除最外周36孔）分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时；（2）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组、电子烟烟液染毒组和阳性对照组处理，各组分别加入孔加入100μl细胞培养基、100μl电子烟烟液染毒溶液和阳性对照SDS溶液，电子烟烟液应设置不少于7个非零染毒浓度，96 孔板的最外周36 个孔中选择其中6个孔加入细胞培养基作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液（100mg/ml）作为染毒溶液背景对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；（4）WST‑8染色：电子烟烟液染毒24 h后，每孔加入10μl 经温育的WST‑8染液，置于37 ℃、5% CO₂条件下孵育1.5‑2h，孵育完成后室温下快速振荡1 min，使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光值A₄₅₀；（5）结果与分析：吸光值A ：A = A_450 nm A(空白对照组)=6个平行孔的吸光度平均值A(培养基背景)=6个平行孔的吸光度平均值A(染毒溶液背景)=6个平行孔的吸光度平均值A(阳性对照)=6个平行孔的吸光度平均值细胞存活率（%）= （A_染毒组‑A_{染毒溶液背景}）/ （A_{空白对照组}‑A_{培养基背景}）注：所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A_阳性对照应小于等于0.3。