[发明专利]一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-8测试方法

说明书

技术领域

本发明涉及电子烟烟液体外细胞毒性的测定，具体说是基于WST-8（一种水溶性四唑盐）染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法。 

背景技术

电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为：电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成：烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用MTT法对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价，结果表明不同电子烟烟液的细胞毒性相差很大。但由于MTT经活细胞线粒体脱氢酶转化生产的蓝紫色结晶物需加入二甲亚砜溶解后方能比色检测，操作步骤繁琐，易对实验结果造成影响。而WST-8（一种水溶性四唑盐）染料是一种应用于细胞增殖和细胞存活率的快速高灵敏度检测试剂，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜。细胞增殖越多，则颜色越深；细胞存活率越低，则颜色越浅。WST-8产生的甲臜是水溶性的，可以省去MTT等方法中后续的溶解步骤。与其同类型的更早期的WST-1染料相比，WST-8 染料稳定性更强，无需低温保存。灵敏度高，溶解性更强。WST-1染料在使用时往往需要加入增强剂以提高响应信号，并对细胞产生一定毒性。而使用WST-8染料无需加入增强剂，且对细胞无明显毒性，使检测结果更加准确。此外，由于WST-8染料对细胞无毒性，细胞使用WST-8染料开展细胞毒性检测后，仍可开展中性红吸收等其他毒理学实验。且可通过更换正常细胞培养基，实现对测试细胞的继续培养。 

电子烟烟液的细胞毒性较低，在进行细胞毒性评价时，需要灵敏度高的试验方法；在开展大量电子烟样品和多个生物指标的毒性测试时，也要求测试方法快速、简便和更好的兼容性。 

  

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，并基于WST-8染料颜色反应的原理，根据电子烟烟液细胞毒性的特点， 建立的一种电子烟烟液体外细胞毒性的测定方法。具有对细胞无损、检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种电子烟烟液体外细胞毒性WST-8测试方法，包括以下步骤： 

1） 溶液制备：

（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。

（2）电子烟烟液染毒溶液： 

由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润剂，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液（100mg/ml），其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到。

（3）WST-8 染液： 4℃保存。 

（4）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS）（200 μg/ml，100% 细胞致死率浓度）。 

2）细胞样本的处理： 

（1）细胞接种：选择贴壁细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞CHO,人肺癌细胞A549和人肺正常上皮细胞BEAS-2B细胞。由于不同细胞系的增殖速率不同，需根据实验所用细胞种类对细胞接种密度进行优化。然后向96孔板（除最外周36孔）分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时；

（2）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组、电子烟烟液染毒组和阳性对照组处理。各组分别加入 100μl细胞培养基、100μl电子烟烟液染毒溶液或阳性对照溶液液，电子烟烟液最佳染毒浓度为10ug/ml~100 ug/ml，应设置不少于7个非零染毒浓度。96 孔板的最外周36 个孔中选择其中6个孔加入细胞培养基作为培养基背景对照，再选择6个孔加入最高电子烟烟液染毒溶液作为染毒溶液背景对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h。