[发明专利]一种检测血浆中长链非编码RNA的方法

摘要

本发明公开了一种检测血浆中lncRNA的方法，通过对血浆TrizolLS预处理后、氯仿和异戊醇混合液提取、异丙醇沉淀、乙醇洗涤、RNA逆转录和PCR检测等步骤，TrizolLS试剂可以较好去除了血中多糖、粘蛋白等杂质，RNA降解较少，氯仿和异戊醇混合液有效解决了TrizolLS强酸条件下三氯甲烷易乳化现象，实现了对血浆中RNA进行高质量、高含量提取，对lncRNA的质量进行荧光定量RT-PCR检测，同时可以检验总RNA（即cDNA）质量的参考Ct值。

主权项

一种检测血浆中长链非编码RNA的方法，其特征在于步骤如下：1）.取血浆300μl置于第一离心管中，加入Trizol LS试剂900μl，漩涡振荡10s，室温静置5分钟，4℃下，12000rpm离心10钟，将上层液体转移到第二离心管中；2）.在第二离心管中加入0.2ml三氯甲烷/异戊醇混合液，所述三氯甲烷/异戊醇混合液中三氯甲烷：异戊醇体积比为24：2，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟后，4℃下12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入第三离心管中；3）.在第三离心管中加入与该上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；4）.在上述沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1ml，颠倒洗涤，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清，再用质量百分浓度75%的乙醇重复颠倒洗涤一次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清，再在4℃下12000rpm离心1分钟，用移液器缓慢吸尽离心管中的液体，得到白色RNA沉淀，室温条件下干燥1分钟，加10μl无RNase水溶解，反复吹打，得到RNA提取液，‑80℃保存备用；5）.用GoScript逆转录试剂盒对上述RNA提取液进行逆转录反应，得到cDNA溶液，置‑20℃保存备用，逆转录反应具体操作依该试剂盒说明书进行；6）.用qPCR Master Mix检测试剂盒对上述cDNA溶液进行荧光定量PCR检测，得到扩增曲线和解链曲线，PCR扩增的上、下游引物分别为RMRP特异性扩增引物、AA174084特异性扩增引物、BM709340特异性扩增引物、LINC00152特异性扩增引物或GAPDH特异性扩增引物，PCR具体操作依检测试剂盒和荧光定量PCR仪说明书进行。