[发明专利]一种检测血浆中长链非编码RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血浆中RNA提取及检测方法，具体涉及一种检测血浆中长链非编码的方法。

背景技术

随着高通量全基因组测序技术的普遍应用,人们惊奇地发现哺乳动物细胞中约98％的转录物为非编码RNA分子(noncoding RNA,ncRNA)。在这些非编码RNA分子中包括目前人们所熟知的看家(housekeeping)非编码RNA(如tRNA和rRNA等)、小非编码RNA(如microRNA和piRNA等),而更多的则是尚待深入研究的长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)分子。

lncRNA是指一类转录本长度大于200个核苷酸(nucleotide,nt)并且不具备编码蛋白质功能的RNA分子。这类分子一般具有高度保守的序列元件、特定的空间二级结构、剪切形式和亚细胞定位，特别是它们中的许多成员被发现具有组织或细胞特异性。这种保守性和特异性决定了lncRNA具有广泛的生物学功能，涉及染色体结构动态变化、端粒维持、亚细胞结构组成、基因组印迹和剂量补偿效应等生命过程。正因为如此，lncRNA不再被认为是基因组转录的“噪音”和RNA聚合酶转录的副产物，而是一类具有重要生物学功能的新型非编码RNA分子。

对于lncRNA的研究，尤其是涉及lncRNA作为肿瘤标志物的研究，离不开各类体液(如血清、血浆)中总RNA的提取、RNA质量鉴定与目标lncRNA的定量检测。目前血浆/血清lncRNA的提取与检测方法如中国专利申请号为CN201010220261.6，名称为“从人血清/血浆样本中分离RNA方法及其PCR验证法”就公开了操作步骤，具体包括血液加热、蛋白酶预处理，加Trizol试剂混匀静置，氯仿抽提，异丙醇沉淀，静置离心，75％乙醇洗涤，离心弃上清，晾干加入焦碳酸二乙酯处理水溶解，得到纯化后的血清/血浆RNA样本。但血浆中含有粘多糖、粘蛋白等物质，在用该Trizol法提取总RNA的过程中，由于多糖的理化性质和RNA非常相似，导致多糖和RNA可以同时沉淀下来，产生富集多糖的透明胶状沉淀，不利于后续的cDNA合成和PCR检测。此外，血浆中总RNA含量低，提取和检测难度大，Trizol法提取血浆中总RNA存在操作步骤复杂、产率低、RNA易降解。截至目前仍没有提取、检测血浆/血清中lncRNA的完善技术方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测血浆中lncRNA的方法，该方法能去除血浆中多糖和粘蛋白等杂质的干扰，有效解决Trizol LS中三氯甲烷乳化现象，对血浆中RNA进行高质量、高含量提取，并对提取的lncRNA进行荧光定量RT-PCR检测。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测血浆中长链非编码RNA的方法，其步骤如下：

1).取血浆300μl置于第一离心管中，加入Trizol LS试剂(Trizol LS与Trizol成分相同，但浓度更高，呈强酸性，适合各种体液的总RNA提取，RNA降解较少，多糖和粘蛋白等杂质去除较多)900μl，漩涡振荡10s，室温静置5分钟，4℃下，12000rpm离心10钟，将上层液体转移到第二离心管中；离心后样品将分为两层，上层为粉红色均质化液体，下层是颜色更深的粘稠状杂质层(多糖和粘蛋白等杂质)；

2).在第二离心管中加入0.2ml三氯甲烷/异戊醇混合液(三氯甲烷：异戊醇体积比为24：2)，漩涡振荡10秒，室温下静置5分钟后，4℃下12000rpm离心15分钟，吸取上层水相移入第三离心管中；三氯甲烷在强酸条件下极易发生乳化现象，一般操作乳化发生率约为45％，但三氯甲烷/异戊醇混合液的乳化现象约5％；

3).在第三离心管中加入与该上层水相等体积的异丙醇，混匀后，4℃条件下静置20分钟，4℃下12000rpm离心10分钟，弃上清得沉淀；

4).在上述沉淀中加入质量百分浓度为75％的乙醇1ml，颠倒洗涤，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清，再用质量百分浓度75％的乙醇重复颠倒洗涤一次，4℃下12000rpm离心5分钟，弃上清，再在4℃下12000rpm离心1分钟，用移液器缓慢吸尽离心管中的液体，得到白色RNA沉淀，室温条件下干燥1分钟，加10μl无RNase水溶解，反复吹打，得到RNA提取液，-80℃保存备用；

5).用GoScript逆转录试剂盒对上述RNA提取液进行逆转录反应，得到cDNA溶液，置-20℃保存备用，逆转录反应具体操作依该试剂盒说明书进行；