[发明专利]一种适用于工业化生产的重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法

摘要

本发明属于生物工程下游蛋白质纯化技术领域，具体涉及重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，具体的通过包涵体裂解、rTPA38DEAE柱纯化、rTPA38蛋白稀释复性、rTPA3830Q柱纯化等步骤最终获得了精纯的rTPA38蛋白。本方法适合工业化大生产，纯化复性一体化，批量可一次性纯化50g至200g包涵体。rTPA38目的蛋白纯度高，可达95%以上，再经过转盐后，完全符合使用要求。

主权项

一种适用于工业化生产的重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，其包括以下步骤：包涵体裂解：取重组表达的rTPA38包涵体，按裂解缓冲液体积（mL）：包涵体重量（g）100：1的比例确定rTPA38包涵体裂解缓冲液的用量，室温搅拌溶解，至溶液基本澄清，无明显大颗粒沉淀存在，用0.45μm的过滤器过滤至20L PP桶中；rTPA38DEAE柱纯化：（1）层析柱平衡：用约4个柱床体积的rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM Tris‑HCl，平衡层析柱，平衡流速约500mL/min；（2）上样：将过滤后的rTPA38裂解液泵入层析柱，流速约500mL/min；（3）洗平：上样结束后，用rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM Tris‑HCl，洗平层析柱，平衡3‑5个柱体积；（4）洗脱1：用rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM Tris‑HCl，20mM NaCl，第一次洗脱，洗脱流速约500mL/min，约冲洗12‑15L，洗脱出的蛋白峰不收集；（5）洗脱2：用rTPA38DEAE柱层析缓冲液：8M尿素，pH8.020mM Tris‑HCl，60mM NaCl，第二次洗脱，洗脱流速约500mL/min；（6）收集：收集洗脱2出现的主峰，含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液于10L PP桶中，层析柱在线处理，第一步洗脱完成；rTPA38蛋白稀释复性：（1）加入rTPA38DEAE柱层析液：在150L稀释复性罐内按稀释复性缓冲液与含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液的体积比例49:1，先加入含目的蛋白的rTPA38的DEAE柱层析液，并打开150L稀释复性罐夹套内的冷冻水进行冷却至保持12℃以下；（2）滴加稀释复性缓冲液，将用硅胶管把150L缓冲液储罐出液口与150L稀释复性罐的进液口连接起来，中间用蠕动泵把硅胶管夹紧，为稀释复性缓冲液滴加提供动力。先把150L缓冲液储罐内的稀释复性缓冲液冷却至15℃以下，开始滴加，稀释复性缓冲液以300ml/min的流速滴加入150L稀释复性罐内，并同时开启150L稀释复性罐的搅拌，以25HZ进行搅拌，从稀释复性缓冲液滴加开始计算，稀释复性约16小时，稀释复性完成。rTPA3830Q柱纯化：（1）30Q柱平衡：用约2‑3个柱床体积的rTPA3830Q柱层析缓冲液：10%甘油、2M尿素、pH8.020mM Tris‑HCl，平衡层析柱，平衡流速约500mL/min；（2）上样：将过滤后的rTPA38稀释复性液泵入层析柱，流速600mL/min；（3）洗平：上样结束后，用约3‑5个柱床体积的rTPA3830Q柱层析缓冲液洗平层析柱；（4）线性梯度洗脱：将rTPA3830Q柱层析缓冲液：10%甘油，2M尿素、pH8.020mM Tris‑HCl，接入层析系统的A泵，rTPA3830Q柱层析缓冲液：200mM NaCl、10%甘油、2M尿素、pH8.020mM Tris‑HCl，接入层析系统的B泵，设定洗脱方式为从100%的A泵洗到100%的B泵，洗脱流速约500mL/min，洗脱时间为120min，总洗脱体积约为10个柱体积；（5）收集：洗脱时，当出现第二个主峰为目的峰，当其280吸光值大于254吸光值时开始收集于10L PP桶中，层析柱在线处理，30Q柱纯化完成。