[发明专利]一种适用于工业化生产的重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程下游蛋白质纯化技术领域，具体涉及重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法。 

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌复合群感染引起的多器官感染性疾病，主要为肺结核。其中我国每年新发患者高达150万。结核杆菌流行病学的一个重要特征是结核分枝杆菌的潜伏感染。结核分枝杆菌潜伏性感染是一种亚临床状态，无放射检查征象，细菌呈休眠状态，约有10％的结核分枝杆菌潜伏性感染人群一生中会发展成为结核病患者。 

目前结核杆菌潜伏感染人群尚无诊断金标准，PPD皮试试验是诊断结核杆菌潜伏感染人群的常用方法，但这一方法有一定的缺陷性，因为试验所用PPD抗原为结核分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反应，诊断特异性差。我国是普遍接种卡介苗的国家，而由于卡介苗接种者和结核杆菌自然感染者对PPD试验的反应在表现上很难区分，即使采用上述的PPD皮试试验强阳性作为判断标准，仍然会有一部分卡介苗接种者以及非致病性分枝杆菌的感染者被纳入结核杆菌潜伏感染人群中，因此导致PPD试验在结核杆菌潜伏感染人群诊断中的实际作用十分有限。需寻找一种新的特异性高、副作用小的制剂代替。重组结核分支杆菌蛋白38K D a(r T P A₃₈)是结核分支杆菌的一种脂蛋白和主要抗原，其诱发豚鼠迟发型超敏反应D T H的效果优于其它单一抗原。用于结核病血清学检测的敏感性和特异性较高。因此，r T P A38蛋白是目前具有较好应用前景的蛋白。 

大肠杆菌表达系统因遗传背景清楚、基因操作简单、表达水平高、发酵成本低和易于工业规模放大等优点而成为药用重组TPA38KDa（recombinant TPA38KD,rTPA38KDa）的理想宿主系统。因MTB与大肠杆菌在进化上近源，所以MTB来源的天然或经简单改造的TPA38KDa编码序列在强启动子（如T7启动子）的控制下很容易获得高效表达，表达水平一般能达到30%以上。与其它在大肠杆菌系统高效表达的目的蛋白一样，TPA38KDa的高效表达产物也是一种无活性的、水不溶的包涵体蛋白，必须采取适当的复性和纯化方法才能获得药用级的产品。但是现有技术中包涵体的初步纯化中得率低，成本高，难以应用于大规模生产。 

但是现有技术中，包涵体复性的回收率大约是15-25%，其占有大肠杆菌生产重组蛋白的绝大部分费用。因此，生物工程的一个很大挑战就是将这种没有活性和不可溶的蛋白更有效的转化为可溶和正确折叠的蛋白，因此，如果能够找到一种溶解的方法使包涵体溶解但又不使其二级结构丧失。这不仅可以使蛋白质复性成功率高，而且可以大大减少其生产活性蛋白的费用。 

因此，针对现有技术中的不足，亟需提供一种可工业化放大、便于质控、效率高、节约生产成本的药用级的重组包涵体蛋白的精纯方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供：一种重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，收集扩增得到的大量包涵体，裂解、过柱纯化、复性、过柱纯化的步骤，最终得到精纯后的具有生物活性的r T P A38蛋白。 

本发明的技术方案：一种重组rTPA38蛋白包涵体精纯的方法，包括如下步骤： 

一、包涵体裂解：取重组表达的rTPA38包涵体，按裂解缓冲液体积（mL）：包涵体重量（g）约100：1的比例确定rTPA38包涵体裂解缓冲液的用量，室温搅拌溶解，至溶液基本澄清，无明显大颗粒沉淀存在，将裂解液置于4℃冰箱过夜。过滤：上柱纯化前用0.45μm的过滤器过滤至20L PP桶中。