[发明专利]一种发根农杆菌介导的转基因甜叶菊遗传转化方法

摘要

一种发根农杆菌介导的转基因甜叶菊遗传转化方法，本方法将预培养后的甜叶菊茎尖外植体浸入携带目的基因的pRI 101‑AN DNA质粒的发根农杆菌菌液中，经侵染、共培养及除菌处理后，将发状根培养在含卡那霉素的筛选培养基上，诱导外植体上形成抗卡那霉素的发状根，诱导发状根形成愈伤组织，分化不定芽，不定芽继续生长形成试管苗，利用PCR扩增方法鉴定携带目的基因的转基因植株。采用本发明提供的技术方案，可将目的基因导入甜叶菊，与聚乙二醇等化学方法的遗传转化相比，减少了从原生质体分离和培养的环节；与基因枪等物理方法的遗传转化相比，不需要昂贵的仪器设备，且操作技术简单。

主权项

一种发根农杆菌介导的转基因甜叶菊遗传转化方法，其特征在于该方法是将预培养后的甜叶菊茎尖外植体浸入含有携带目的基因和筛选基因质粒的发根农杆菌菌液中，具体包括以下步骤：a.从甜叶菊试管苗上剪取1‑1.5cm长的茎尖，接种到预培养培养基上，光照培养1‑3天，培养温度为25±1℃、光照强度为3000‑4000Lux、光照时间为14h，作为遗传转化的受体；所述预培养培养基为：MS+0.1mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.6‑5.8；b．挑取发根农杆菌的单菌落，接种到含有50mg/mL利福平的20mL YEP培养基中，于28℃下，180rpm振荡培养30h后，取50μL菌液接种到50mL YEP液体培养基中，于28℃下，180rpm振荡培养至OD600为0.6；c.将步骤a中获得的茎尖外植体浸入步骤b中获得的发根农杆菌菌液中，在含100μmol/L乙酰丁香酮的条件下侵染30min；d.使用无菌滤纸吸取步骤c中外植体的多余菌液，转移到共培养培养基上，共培养5天，共培养温度为25℃；所述共培养培养基为：MS+0.1mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.6‑5.8；e.步骤d获得的外植体转入除菌培养基上，进行除菌培养，除菌培养初期2周内每隔3‑4天转移至新的除菌培养基，以后每隔一周转移一次，直至除菌完全；所述除菌培养基为：MS+0.1mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+100 mg/L Cef+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.6‑5.8；f.将步骤e所得的发状根转入筛选培养基中，培养30d后，转至愈伤组织诱导培养基中，培养至诱导出愈伤组织，并再生不定芽；所述筛选培养基为:MS+0.1mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+100mg/L kan+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.6‑5.8；g.待f中不定芽生长至2‑3cm，转至生根培养基中，培养温度为25±1℃、光照强度为3000‑4000Lux、光照时间为14h；所述生根培养基为：MS+0.1mg/L 6‑BA+0.05mg/L NAA+100mg/L kan+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH5.6‑5.8；h.采用CTAB法提取转基因甜叶菊的DNA，作为被检测的模板，采用PCR法鉴定转基因植株，所用特异性引物根据所转目的基因设计；所述的发根农杆菌含有目的基因，含有携带目的基因的表达载体的发根农杆菌是通过以下方法构建的：将目的基因插入表达载体启动子之后，通过冻融法将构建好的携带目的基因的表达载体导入发根农杆菌，经抗性筛选，获得含有携带目的基因的表达载体的发根农杆菌。