[发明专利]一种发根农杆菌介导的转基因甜叶菊遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术中的植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种发根农杆菌介导的发根农杆菌介导的转基因发根农杆菌介导的转基因甜叶菊遗传转化的方法。

背景技术

植物细胞的遗传转化是植物基因工程的一个关键环节。自Abel等(1986)将烟草花叶病毒(TMV)衣壳蛋白cDNA导入烟草细胞，获得抗TMV病毒的转基因烟草植株后，先后发展了许多植物遗传转化方法和技术。

甜叶菊自1978年由中国农科院从日本引入我国，至今已遍及全国，其叶片含有天然甜味剂甜菊醇糖苷(steviol glycosides，SGs)，是一种新型糖料作物。我国已成为世界上最大的甜叶菊生产国和甜菊醇糖苷出口国。目前，全国的甜叶菊生产均存在以下问题：由于日本培育的守田2号及守田3号糖苷含量较高，在甜叶菊栽培品种中长期具有支配地位，曾垄断全国的甜叶菊种植。选育优良的具有独立知识产权甜叶菊新品种已成为亟需解决的问题。目前尚未有甜叶菊转基因系统建立的报道。

发明内容

本发明直接用甜叶菊试管苗茎尖作为外植体，取材方便。在已建立高效组培快繁体系的基础上，建立了以茎尖为外植体的发根农杆菌介导的发根农杆菌介导的转基因发根农杆菌介导的转基因甜叶菊遗传转化的方法，减少所使用仪器的费用，使实验操作技术容易在普通实验室进行，为今后利用转基因技术对甜叶菊进行遗传改良提供技术上的支持。

MS (Murashige and Skoog, 1962)培养基，是植物细胞工程的常用培养基，广泛地用于植物的组织培养，效果良好。本发明所用的植物培养基均以MS为基本培养基，附加了不同浓度的激素。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1) 提取携带目的基因的重组pRI 101 AN-DNA质粒

将含有重组pRI 101 AN-DNA质粒的大肠杆菌DH-5α接种到含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37 ℃、220rpm的条件下过夜培养；碱裂解法提取重组pAHC25质粒DNA后，酶切鉴定重组pRI 101 AN-DNA质粒。

碱裂解法能够提取细菌的质粒，属于一般分子生物学常规操作。

(2) 准备遗传转化使用的甜叶菊茎尖外植体

从高5 cm左右的试管苗上剪取1-1.5cm长的茎尖，接种到预培养培养基上，在温度25±1 ℃、光照强度40001x、光周期为14小时光照和10小时黑暗的条件下培养1-3天后，作为遗传转化的受体。

预培养培养基为：MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 琼脂，pH 5.6-5.8。

(3) 甜叶菊茎尖外植体的遗传转化

取活化工程菌液转入无菌离心管中，室温 4000g 离心 5min，去上清，用新鲜的 MS 液体培养基重悬稀释至 OD₆₀₀值为0.6,时倒入无菌锥形瓶中，在重悬菌液中加入不同体积的50 mmol/L乙酰丁香酮至终浓度为100 μmol/L；

预培养的外植体在菌液中浸泡30 min后，取出外植体在无菌滤纸上吸干多余菌液，接种与共培养培养基)，25℃，4000 lx光照条件下共培养5d；

将共培养的外植体转移到除菌培养基上进行除菌培养，连续转接至新的除菌培养基中，以除去发根农杆菌。

共培养培养基为：MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 琼脂，pH 5.6-5.8。

除菌培养基为： MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 100mg/L Cef + 30g/L 蔗糖 + 6 g/L 琼脂，pH 5.6-5.8。

(4) 筛选培养转基因发状根、诱导抗性愈伤组织形成和植株再生

将生长旺盛长度达到2cm ，完全除菌、生长速度快、分枝多的发状根转移到筛选培养基中筛选,并大量培养；

将经筛选培养基筛选的发状根的根尖剪成1cm 左右的片段，移入愈伤组织诱导培养基中，愈伤组织分化产生不定芽，不定芽继续生长形成试管苗。

(5) PCR扩增鉴定转基因植株

采用CTAB法提取转基因植株的DNA，作为被检模板，根据已知序列设计引物，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)法对候选植株进行鉴定。