[发明专利]一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法

摘要

本发明公开了一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，具体包括pBD载体的制备；AIDA-I表达元件的获取；CMV真核表达元件的获取；构建含有AIDA-I的表达元件的载体pA以及目标载体pAC的构建。本发明首次实现在同一载体中整合AIDA-I表面展示系统及CMV表达元件，通过该载体上AIDA-I元件将外源蛋白展示于革兰氏阴性菌表面，并通过该载体的真核表达元件将另一种外源蛋白表达于真核细胞中，为疫苗研发、全细胞催化剂、全细胞吸附剂及多肽库筛选提供了更多的候选载体。

主权项

1.一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：pBD载体的制备：合成一对互补DNA序列，序列如下：5‘-AATTCTTAGATCTCTTCATACTAGTCATGTTTGACTCATCGATA-3’；5‘-AGCTTATCGATGAGTCAAACATGACTAGTATGAAGAGATCTAAG-3’；将上述两条DNA序列通过退火处理得到双链DNA片段；用EcoR I和Hind III双酶切pBR322载体后，以所述的双链DNA片段替代pBR322载体中被EcoR I和Hind III酶切掉的片段，得到载体pBD；AIDA-I表达元件的获取：启动子的获取：取大肠杆菌E393，超纯水中煮沸10分钟后离心分离，取上清作为PCR模板；合成特异性引物Seq NO.1和SeqNO.2，通过对载体pBR322进行PCR扩增得出AIDA-I启动子，回收此产物备用；AIDA-I的C-端片段获取：合成特异性引物Seq NO.3和Seq NO.4，通过对载体pBR322进行PCR扩增得出AIDA-I的C-端片段，回收此产物备用；AIDA-I表达元件的获取：以AIDA-I启动子和AIDA-I的C-端片段为模板，用Seq NO.1和Seq NO.4为引物，通过融合PCR扩增出AIDA-I的表达元件；CMV真核表达元件的获取：合成引物Seq NO.5和Seq NO.6，通过对pCDNA3.1载体PCR扩增得到CMV真核表达元件；构建含有AIDA-I的表达元件的载体pA：利用凝胶回收试剂盒回收步骤获得的AIDA-I表达元件，将回收所得的AIDA-I表达元件与PGEM-T克隆载体连接、4℃连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列；取测序鉴定正确的AIDA-I表达元件质粒及步骤制备的载体pBD，分别用StyI和ApeI双酶切得到酶切片段；利用凝胶回收试剂盒回收AIDA-I表达元件质粒的1600bp条带及pBD载体的3000bp酶切片段；将回收所得的两份酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体pA；目标载体的构建：利用凝胶回收试剂盒回收步骤获取的CMV真核表达元件，将回收所得的CMV真核表达元件与PGEM-T克隆载体进行连接、4℃连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列，取测序鉴定正确的CMV真核表达元件质粒为CMV真核表达元件载体；将步骤构建的载体pA及CMV真核表达元件载体分别用BglII和ApeI双酶切得到酶切片段，回收载体pA的4600bp条带及CMV真核表达元件载体的1200bp酶切片段，将回收所得的酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体即为所述的AIDA-I表面展示系统和CMV真核表达元件共表达载体；所述引物Seq NO.1为CCTTGGTTCACATGGCTGTAATGGATG；      Seq NO.2为GTTATTCATCTAGACGGTACCGCCTGAAATATTTACTGCAAATGC； Seq NO.3为GCGGTACCGTCTAGATGAATAACAATGGAAGCATTG；Seq NO.4为GAATTCTAAGATCTAAACTAGTCCTCAGAAATGAGGGCCG；Seq NO.5为ACTAGTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC；Seq NO.6为AGATCTTCGCTTGCTGTCCATAAAAC。