[发明专利]一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体涉及一种AIDA-I表面展示系统和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法。

背景技术

运用DNA重组技术在噬菌体、细菌、真菌、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术等方面得到了广泛应用。

细菌表面展示技术是其中一种重要的微生物表面展示方法，与噬菌体、真菌及病毒表面展示技术相比，具有操作简便、系统多样、稳定性强及高效的特点。目前，细菌表面展示系统在重组疫苗开发、全细胞催化剂、全细胞吸附剂及多肽库筛选等方面具有广泛的应用前景。

细胞表面展示体系通常由运载蛋白、靶蛋白和受体菌三者组成，其中运载蛋白与靶蛋白以融合蛋白的方式交联，其中运载蛋白的功能是将靶蛋白引导并锚定于细胞表面特定部位，是影响展示系统性能的关键因素。

在众多的细菌表面展示系统中，AIDA-I是一种高效的展示系统。AIDA-I是革兰氏阴性菌的                                                型分泌系统的重要成员，无需其它蛋白的辅助，其即可通过C-端氨基酸的β折叠嵌入细菌膜表面、形成桶装结构，通过C-端的链接区将N-端的蛋白展示到细菌表面。

另外，在通过表达技术研究基因功能的过程中，最常用的研究手段是真核表达。传统的方法就是通过分子生物学手段将将目的基因片段连接到真核启动子下游，整合到细胞基因组中后指导外源蛋白表达。

但是，现有技术中还没有关于将细菌表面展示系统与真核表达元件整合与同一表达载体，以独立高效的表达两种外源蛋白的报道。

发明内容

本发明涉的目的是提供一种整合了大肠杆菌AIDA-I表面展示系统及CMV真核表达元件的表达载体的构建方法，通过该载体上AIDA-I元件将外源蛋白展示于革兰氏阴性菌表面，并通过该载体的真核表达元件将另一种外源蛋白表达于真核细胞中。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种AIDA-I表达元件和CMV真核表达元件共表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

 pBD载体的制备：合成一对互补DNA序列，序列如下：  

5‘-AATTCTTAGATCTCTTCATACTAGTCATGTTTGACTCATCGATA-3’；

5‘-AGCTTATCGATGAGTCAAACATGACTAGTATGAAGAGATCTAAG-3’；

将上述两条DNA序列通过退火处理得到双链DNA片段；

用EcoR I和Hind III双酶切pBR322载体后，以所述的双链DNA片段替代pBR322载体中被EcoR I和Hind III酶切掉的片段，得到载体pBD；

 AIDA-I表达元件的获取：

启动子的获取：取大肠杆菌E393，超纯水中煮沸10分钟后离心分离，取上清作为PCR模板；合成特异性引物Seq NO.1和SeqNO.2，通过对上述模板进行PCR扩增得出AIDA-I启动子，回收此产物备用；

AIDA-I的C-端片段获取：合成特异性引物Seq NO.3和Seq NO.4，通过对中所得的模板进行PCR扩增得出AIDA-I的C-端片段，回收此产物备用；

AIDA-I表达元件的获取：以AIDA-I启动子和AIDA-I的C-端片段为模板，用Seq NO.1和Seq NO.4为引物，通过融合PCR扩增出AIDA-I的表达元件；

 CMV真核表达元件的获取：合成引物Seq NO.5和Seq NO.6，通过对pCDNA3.1载体PCR扩增出CMV真核表达元件；

构建含有AIDA-I的表达元件的载体pA：利用凝胶回收试剂盒回收步骤获得的AIDA-I表达元件，将回收所得的AIDA-I表达元件与PGEM-T克隆载体连接、4℃连接过夜；取连接产物转化至DH10B的感受态细菌，挑菌并酶切鉴定获得阳性质粒；进一步测序，鉴定该质粒的编码基因序列；

取测序鉴定正确的AIDA-I表达元件质粒及步骤制备的载体pBD，分别用StyI和ApeI双酶切得到酶切片段；利用凝胶回收试剂盒回收AIDA-I表达元件质粒的1600bp条带及pBD载体的3000bp酶切片段；将回收所得的两份酶切片段连接过夜，取连接产物转化感受态DH10B菌，挑菌，利用质粒小抽试剂盒抽提质粒酶切鉴定，筛选出序列正确的载体pA；