[发明专利]一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法

摘要

RNA(Ribonucleic acid)在活体生物细胞内普遍存在，是生物的遗传信息中间载体，参与DNA的转录和蛋白质的合成。随着环境因子发生改变，RNA会在第一时间作出反应，离体RNA或者死亡细胞的RNA极易降解。因此，RNA被作为检测当前有活性微生物状态的第一指标。提取完整的、高质量的小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子RNA是进一步开展转录组学、条锈菌存活数量监测等研究的基础。建立的小麦条锈菌RNA提取方法涉及的关键技术包括试验材料完全转移、防止氧化等。保障小麦条锈菌完全转移及提高研磨效果的关键预处理溶液是pH为8.0的0.01M Tris‑HCl；涉及的防止氧化的主要成分有1％SDS(W∶V)、1％∶‑巯基乙醇(V∶V)和16％PVP(W∶V)。

主权项

1.一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法，包括试验材料预处理、裂解、RNA萃取、RNA沉淀、及洗涤沉淀步骤，所述方法具体如下：(1)试验材料完全转移及防止氧化的预处理：称取5mg小麦条锈菌夏孢子，装于1.5mL离心管中，轻轻弹管壁，至所有孢子置于管底，在管中加入30μL pH8.0的0.01M Tris‑HCl前期预处理液，冰浴静置5min，在预冷研钵中加入30mL液氮速冻研钵，同时将上述离心管在新液氮中速冻，待液氮沸腾停止后，将管中的孢子转移至经液氮预冷的研钵中，快速用力研磨2‑3次，每次加入20‑30mL的液氮，之后，将细末粉状物刮取下来，转移至前期准备好的装有800μL裂解提取液的2.0mL的离心管中，在涡旋仪上涡旋2min后，冰浴静置10min；(2)萃取，去除杂质：加入萃取液，颠倒混匀后，冰浴静止10min，4℃，12000rpm离心15min，取上清；加入300μL的pH4.85M NaAc和700μL的氯仿，颠倒混匀，冰浴静止8min，4℃，12000rpm离心15min，取上清；(3)RNA沉淀：加入常规RNA沉淀液，‑20℃放置30min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清，加入500μL的80％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加入500μL的无水乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，得到小麦条锈菌RNA。