[发明专利]一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法

说明书

RNA(Ribonucleic acid)在活体生物细胞内普遍存在，是生物的遗传信息中间载体，参与DNA的转录和蛋白质的合成。随着环境因子发生改变，RNA会在第一时间作出反应，离体RNA或者死亡细胞的RNA极易降解。因此，RNA被作为检测当前有活性微生物状态的第一指标。提取完整的、高质量的小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子RNA是进一步开展转录组学、条锈菌存活数量监测等研究的基础。建立的小麦条锈菌RNA提取方法涉及的关键技术包括试验材料完全转移、防止氧化等。保障小麦条锈菌完全转移及提高研磨效果的关键预处理溶液是pH为8.0的0.01M Tris‑HCl；涉及的防止氧化的主要成分有1％SDS(W∶V)、1％∶‑巯基乙醇(V∶V)和16％PVP(W∶V)。

技术领域：本发明涉及一种快速高效的小麦条锈菌RNA提取方法。

技术背景：小麦条锈菌是专性寄生菌，不能利用培养基进行人工培养，其繁殖体夏孢子、冬孢子、吸器、菌丝体等难以获得，其小麦条锈菌夏孢子RNA的提取受诸多条件制约显得更加困难。传统的夏孢子提取方法是称取几十克的夏孢子转移到研钵中液氮研磨。但在提取过程中发现，将称取好的夏孢子倒入液氮中时，夏孢子由于质量很轻容易飞溅，而且一少部分夏孢子会沾到管壁上，不能完全转移到研钵中。同时，液氮研磨后转移材料时发现，研磨后的夏孢子容易沾到研钵底部，很难完全刮取下来。以上几种原因常常导致大量夏孢子在提取过程中被损失掉了。目前，小麦条锈菌RNA提取多采用试剂盒的方法，但成本很高。

我们研制出了一种可快速、大量、高效、低成本的针对小麦条锈菌RNA的提取方法。具体步骤如下：

1.在RNA超净工作台中，取出需要数量的2.0mL RNase free离心管，加入800μL裂解提取液(裂解提取液成分是：0.02M Tris-HCl pH＝8.0；0.2M NaCl；0.005M EDTA；1％SDS)，1％β-巯基乙醇和16％PVP各10μL，混匀后将离心管置于冰上，备用。

2.称取5mg小麦条锈菌夏孢子，装于1.5mL离心管中，轻轻弹管壁，至所有孢子置于管底。在管中加入30μL的0.01M Tris-HCl(pH＝8.0)，冰浴静置5min帮助缓冲液渗入孢子中。

3.在预冷研钵中加入20mL液氮速冻研钵，同时将上述离心管在新液氮中速冻，待液氮沸腾停止后，倒转离心管在桌上轻轻一置，管中的孢子和缓冲液呈完整冰坨状与管底剥离，倒入预冷的研钵中。加入液氮快速用力研磨2-3次后，将细末粉状物刮取下来，集中转移至前期准备好的装有裂解提取液的2.0mL的离心管中，涡旋2min后，冰浴静置10min。

4.加入萃取液，其主要成分有约270μL的5M NaAc(pH＝4.8)和750μL的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，冰浴静置10min，4℃，12000rpm离心15min，取上清(约1000μL)转入无RNA的2.0mL离心管，加入约300μL的5MNaAc(pH＝4.8)和700μL的氯仿，冰浴静置8min，4℃，12000rpm离心15min，取上清，转入RNase free的2.0mL离心管，加入约120μL的3M NaAc(pH＝5.2)和800μL的异丙醇，-20℃放置30min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清。

5.加入500μL的80％乙醇，轻轻弹管壁帮助洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，加入500μL的无水乙醇，轻轻弹管壁帮助洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

6.加入经DEPC处理的RNase free水43.5μL溶解RNA，然后加入5μL的10×DNaseBuffer、1μL DNase I和0.5μL的RNase酶抑制剂，轻微混匀后37℃水浴30min。

7.加入约5μL的3M NaAc(pH＝5.2)和165μL的异丙醇，沉淀30min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清。