[发明专利]利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B12含量的方法

摘要

利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，本发明涉及测定维生素B₁₂含量的方法。本发明要解决现有测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法存在实验体系大，测试费用高，样品容易污染，操作复杂及测试结果偏差大的问题。方法：一、样品的制备；二、标准工作液的制备；三、工作菌液的制备；四、96微孔板培养样品；五、测试并计算B₁₂含量，进而计算出婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量。本发明利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法实验体系小，测试费用低，样品不易污染，操作简单及测试结果稳定。本发明用于利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量。

主权项

1.利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，其特征在于利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的方法是按以下步骤进行：一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品液体过滤除菌，得到过滤除菌后的样品，再将过滤除菌后的样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，再将储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；五、测试并计算B₁₂含量：使用酶标仪对在96微孔板培养后的样品进行浊度分析，得到不同浓度的标准工作液浊度及稀释后样品浊度，以不同浓度标准工作液的浊度读数相对于各梯度水平标准工作液浓度绘制B₁₂标准曲线，再通过测得的稀释后样品浊度即可从B₁₂标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度并利用样品中B₁₂含量计算公式，进而计算出样品中B₁₂含量；样品中B₁₂含量计算公式：其中：X为样品中维生素B₁₂的含量，单位为μg/100g；C为从标准曲线查得的样品中维生素B₁₂的浓度，单位为ng/mL；F为稀释后样品的体积，单位为mL；m为过滤除菌后的样品质量，单位为g。