[发明专利]利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B12含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及测定维生素B₁₂含量的方法。

背景技术

目前，国外检验婴幼儿食品和乳品中必需营养素生物素的测定主要采用美国公职分析化学家学会(AOAC)提供的AOAC Official Method952.20Cobalamin(Vitamin B₁₂Activ ity)方法，而国内检验婴幼儿食品和乳品中必需营养素生物素的测定采用《中华人民共和国国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的测定》GB5413.14-2010。

但现有测定方法存在实验需要较大量的玻璃器皿，不但占用实验室空间，而且难以保管和洗刷；检验体系较大，因此需要较多化学试剂、培养基和标准物质；由于维生素测定菌株对外界污染较敏感，所用玻璃器皿需要严格灭菌，实验准备工作较繁琐；盛载所需玻璃器皿体积较大，需要培养空间较大，操作步骤复杂导致实验污染几率较大，失误率较高；操作步骤复杂，实验量大，对实验人员体力和技术能力要求较高，个人偏差明显，因此同一标准曲线附带检验样品数量有限，单个样品检验费用较高等缺点。

综上所述，现有测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法存在以下问题：1.存在实验体系大；2需要大量实验器皿，较多化学试剂、培养基和标准物质，因此测试费用高；3.样品容易污染，操作复杂；4.测试结果偏差大。

发明内容

本发明要解决现有测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法存在实验体系大，需要较多化学试剂、培养基和标准物质，样品容易污染，失误率高，测试结果偏差大，操作复杂，测试费用高的问题，而提供利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂的方法。

利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B₁₂含量的方法，具体是按照以下步骤进行的：

一、样品的制备：将婴幼儿食品和乳品液体过滤除菌，得到过滤除菌后的样品，再将过滤除菌后的样品加入到预灭菌一级水中稀释，得到稀释后样品；

所述的过滤除菌后的样品质量与预灭菌一级水的体积比为(0.001～0.15)g:1mL；

二、标准工作液的制备：将标准物质加入到体积浓度为25%的乙醇中，配制成储备液，再将储备液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到中间液，然后将中间液加入到体积浓度为25%的乙醇中，得到标准工作液；

所述的标准物质为sigma B₁₂标准品；所述的储备液浓度为10μg/mL；所述的中间液浓度为100ng/mL；所述的标准工作液浓度为0.01ng/mL～0.15ng/mL；

三、工作菌液的制备：在温度为34℃～37℃下，将莱士曼氏乳酸杆菌的一个单独菌落用10mL复壮液体培养基培养18h～24h，再从复壮液体培养基中取菌株，然后在温度为34℃～37℃下，将取出的菌株更换10mL复壮液体培养基继续传代2代～3代至2个～3个麦氏浊度，每代培养18h～24h，得到增强活力后的菌株，将增强活力后的菌株置于温度为2℃～5℃的冰箱内保存备用，在保存备用过程中每15天更换新鲜的复壮液体培养基传代一次，传代温度为34℃～37℃，得到保存备用的菌株，再将保存备用的菌株在2000r/min下离心2min～3min，得到离心后的菌株，将离心后的菌株去掉上清液，再向去掉上清液的离心菌株内加入3次生理盐水，每次生理盐水的体积为10mL，混合均匀，得到菌泥，最后将菌泥与复壮液体培养基混合至0.5个～0.6个麦氏浊度，得到工作菌液；

四、96微孔板培养样品：取150μL工作菌液分别加入96微孔板全部微孔中，得到含工作菌液的96微孔板，再取5个不同浓度的标准工作液分别加到含工作菌液的96微孔板不同微孔中，每个浓度的标准工作液取3次，每次取标准工作液150μL，然后再取3次稀释后样品分别加到含工作菌液的96微孔板其余微孔中，每次取稀释后样品150μL，得到加样后的96微孔板，将加样后的96微孔板使用无菌膜覆盖并在温度为35℃～37℃下培养43h～49h，得到在96微孔板培养后的样品；