[发明专利]一种利用AFLP-毛细管电泳技术鉴别灯盏花新品种千山2号的方法

摘要

本发明公开一种利用AFLP-毛细管电泳技术鉴别灯盏花新品种千山2号的方法，属分子标记技术领域。该方法包括样本DNA的提取、DNA样本的双酶切及双酶切产物的连接、连接产物的预扩增、选择性扩增、AFLP-毛细管电泳检测、结果分析与鉴别。该方法成功地建立了灯盏花新品种千山2号的AFLP-毛细管电泳分离图谱，能容易、精确地鉴别样品是否是灯盏花新品种千山2号，为保护灯盏花新品种千山2号提供了科学的依据。

主权项

一种利用AFLP‑毛细管电泳技术鉴别灯盏花新品种千山2号的方法，包括以下步骤：（1）样本DNA的提取，以千山2号为对照样本，分别取对照样本和待鉴别样本0.1g，分别按照CTAB法提取总DNA，总DNA经RNA酶纯化，并用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，OD值达到1.8‑2.0，将总DNA稀释到200ng/μl，分别得对照DNA样本和待鉴别DNA样本；（2）AFLP扩增①DNA样本的双酶切及双酶切产物的连接，分别将步骤（1）获得的对照样本的DNA样本和待鉴别样本的DNA样本用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ双酶切，在各双酶切产物中加入EcoRⅠ接头、MseⅠ接头和T4连接酶进行连接，得到对照样本的连接产物和待鉴别样本的连接产物，所述的EcoRⅠ接头的序列由A序列和B序列组成，所述的EcoRⅠ接头的A序列的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述的EcoRⅠ接头的B序列的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述的MseⅠ接头的序列由C序列和D序列组成，所述的MseⅠ接头的C序列的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述的MseⅠ接头的D序列的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；②连接产物的预扩增，分别在步骤（2）①获得的对照样本的连接产物和待鉴别样本的连接产物中加入预扩增引物进行预扩增，预扩增反应热循环程序为：94℃预变性5min，然后进入循环，每个循环94℃变性35s，56℃退火40s，72℃延伸2min，共35个热循环，4℃冷却后，取出对照样本的预扩增产物和待鉴别样本的预扩增产物在‑20℃保存；所述的预扩增引物由上游引物E和下游引物M组成，所述的上游引物E的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，所述的下游引物M的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；③选择性扩增，分别将步骤（2）②获得的对照样本的预扩增产物和待鉴别样本的预扩增产物用ddH2O稀释20倍后，分别加入选择性扩增引物进行选择性扩增，选择性扩增为两段循环，94℃预变性5min后，第一段循环为：94℃变性50s，65℃退火30s，每个循环降低0.7℃，72℃延伸2min，12个循环，72℃延伸10min；第二段循环为：94℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸2min，23个循环，72℃延伸10min，4℃冷却后，分别取出对照样本的选择性扩增产 物和待鉴别样本的选择性扩增产物在‑20℃保存；所述的选择性扩增引物由上游引物E‑ACC和下游引物M‑CAG组成，所述的上游引物E‑ACC的碱基序列如SEQID NO：7所示，所述的下游引物M‑CAG的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；（3）AFLP‑毛细管电泳检测，将步骤（2）③获得的对照样本的选择性扩增产物和待鉴别样本的选择性扩增产物在CEQ8000遗传分析系统上检测，其上样液甲酰胺10μl，Size standard‑6000.2μl，稀释10倍的Sample3μl；电压6KV，电流4Ma，时间50min；选择性扩增产物在毛细管中电泳分离，导出AFLP‑毛细管电泳分离图谱；（4）结果分析与鉴别根据步骤（3）导出的AFLP‑毛细管电泳分离图谱进行分析，当待鉴别样本的AFLP‑毛细管电泳分离图谱的特征峰为单一的一个峰，而且特征峰大小为119bp时，则该待鉴别样本是灯盏花新品种千山2号，否则不是灯盏花新品种千山2号。