[发明专利]一种利用AFLP-毛细管电泳技术鉴别灯盏花新品种千山2号的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及随机扩增长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）-毛细管电泳技术，分子鉴别灯盏花新品种千山2号。

背景技术

灯盏花[Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz.]为菊科飞蓬属多年生植物，是治疗心脑血管类疾病的良好天然药物，以其总黄酮及其灯盏乙素、咖啡酰奎宁酸类化合物为活性成分开发有4个注射液品种，是云南省最具发展潜力的药用植物之一。

灯盏乙素（scutellarin）是灯盏花的主要功能成分之一。灯盏乙素含量高低决定了药材的疗效，也是鉴别药材质量好坏的重要标准。由于社会对灯盏花药材需求量的不断增长，野生资源已经远远不能满足社会需求。本发明人在灯盏花种质资源收集与评价的基础上（杨生超等.灯盏花种质资源群体表型多样性研究.西北植物学报，2008，28（8）:1573-1579），系统地开展了灯盏花的育种研究（杨生超等，灯盏花新品系选育及农艺与品质性状比较，中国中药杂志，2010，35（5）:554-557），从驯化栽培的灯盏花种源QS-1（泸西种源）天然异交群体中选育出灯盏花新品种千山2号，灯盏花新品种千山2号于2009年通过了由云南省农业厅、云南省农业科学院、中科院昆明植物研究所、云南农业大学、泸西县农业局等单位的专家组成的药用植物品种鉴定专家组的品种鉴定。从2009年至今，千山2号已经累计推广超过2000hm²，极大地促进了经济发展和农民增收。

千山2号的主要农艺、经济性状为:叶主要集中于基部，基部叶密集，莲座状，花期生存，多为匙形，少为倒披针形，长16.7～35.7cm，宽1.45～2.6cm，其植株中灯盏乙素含量为3.5%左右，亩含灯盏乙素为11.38kg左右，较对照高39.31%（对照QS-1），适应性较好、抗逆性强，田间有轻微的霜霉病和根腐病发生，未见其他病害发生，抗病性好。

灯盏花种植目前采用“公司”+“农户”的模式，新品种种子很容易外流。不同地区的野生灯盏花药材的灯盏乙素含量不同，如云南（灯盏乙素含量0.713%）最高，四川（灯盏乙素含量0.61%）和贵州（灯盏乙素含量0.539%）次之，广西（灯盏乙素含量0.443%）最低（刘鹏等，HPLC法测定不同产地灯盏细辛中灯盏乙素的含量，第四军医大学学报，2006，27（9）:781）。由于千山2号新品种植株中灯盏乙素含量高，千山2号药材的市场价格比其它灯盏花药材的价格高2倍多，收购灯盏花药材时也发现一些利用灯盏乙素含量显著低于千山2号的野生灯盏花以次充好的现象，造成药材市场混乱、质量良莠不齐，给药品质量控制带来了极大的隐患，为此研究灯盏花新品种千山2号的快速、准确的分子鉴别方法，对于保护新品种权，鼓励创新、医药质量控制均具有重要意义。

目前，以DNA水平为基础的分子检测鉴别技术包括PCR技术、RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术、SSR和ISSR技术、多位点小卫星DNA指纹技术和微卫星标记技术、基因芯片技术以及SNP技术等。AFLP分子标记技术（扩增片段长度多态性，Amplified Fragment Length Polymorphism）具有DNA需要量少、检测效率高、多态性高、可靠性好、重复性高等优点，已在动物学、植物学、医学研究上应用。植物学研究中的应用主要在种质资源鉴定、指纹图谱构建等。但到目前为止，还没有应用AFLP分子标记技术对灯盏花进行分子鉴别，也没有用AFLP-毛细管电泳技术对不同区域灯盏花进行分子鉴别及对灯盏花新品种千山2号的分子鉴别。

发明内容

本发明目的是提供一种能快速、准确、方便地对灯盏花新品种千山2号进行分子鉴别的方法，为新品种保护提供科学依据，促进灯盏花产业的持续健康发展。

本发明所提供的一种利用AFLP-毛细管电泳技术鉴别灯盏花新品种千山2号的方法，包括以下步骤：

（1）样本DNA的提取，以千山2号为对照样本，分别取对照样本和待鉴别样本0.1g，分别按照CTAB法提取总DNA，总DNA经RNA酶纯化，并用紫外分光光度计测定260nm和280nm下的光密度值，OD值达到1.8-2.0，将总DNA稀释到200ng/μl，即得对照DNA样本和待鉴别DNA样本；

（2）AFLP扩增