[发明专利]小型猪细胞色素P450重组酶的构建表达及应用

摘要

本发明提供一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法及应用。本发明通过克隆表达小型猪CYP3A22和CYP3A46基因，获得功能良好的pCYP3A22和pCYP3A46重组酶，并应用于小型猪与人CYP3A的单酶的相似性评价，为药物临床前药代动力学研究提供指导。本发明提供的重组酶可在临床前药代动力学体外筛选合适的实验动物模型中的应用，通过体外孵育实验考察某经CYP3A代谢药物被小型猪CYP3A和人CYP3A重组酶的代谢情况是否相似，判断该药物的临床前试验是否适合选用小型猪作为其药代动力学研究的动物模型。该体外结果同时可为体内研究提供基础数据及参考依据。

主权项

一种小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）以巴马小型猪的肝cDNA为模板，通过设计CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，获得巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2所示，将该基因片段添A后与pMD18‑T连接得pMD18‑T/CYP3A22和pMD18‑T/CYP3A46质粒，再将其转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞进行质粒扩增；所述引物序列如下：SEQ ID No:3 CYP3A22上游引物：ATGGACCTGATCCCAAGCTT，SEQ ID No:4 CYP3A22下游引物：TCAGGCTCCACTTACGGTC，SEQ ID No:5 CYP3A46上游引物：ATGGACCTGATCCCAGGCTT，SEQ ID No:6 CYP3A46下游引物：TCAGGCTCCACTTGTGGTC；（2）以获得的pMD18‑T/CYP3A22和pMD18‑T/CYP3A46质粒为模板，通过设计含有BamHI，SAlI两个酶切位点的特定引物，获得两端含特定酶切位点的巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，SalI两个酶进行双酶切得到CYP3A22、CYP3A46两个基因片段；引物序列如下：SEQ ID No:7 CYP3A22上游引物：GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT，SEQ ID No:8 CYP3A22下游引物：ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC，SEQ ID No:9 CYP3A46上游引物：GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAGGCTTTTC，SEQ ID No:10 CYP3A46上游引物：ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTGTGGTCC；（3）将载体质粒pFastBac1也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述两个基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将CYP3A22、CYP3A46基因片段与载体片段连接，构建pFastBac‑CYP3A22，pFastBac‑CYP3A46两种质粒；（4）再将质粒转化入E.coliDH10Bac感受态细胞进行转座，获得Bacmid‑CYP3A22和Bacmid‑CYP3A46重组粘粒；（5）将重组粘粒别转染草地夜蛾卵巢细胞（Sf9），获得重组病毒v‑CYP3A22和v‑CYP3A46，再分别将以上两种重组病毒与v‑CYPOR和v‑CYPb5共感染Sf9细胞，即在细胞内高表达CYP3A22和CYP3A46重组蛋白；通过Western Bolt验证重组蛋白的表达，通过CYP3A经典底物睾酮和咪达唑仑验证CYP3A22和CYP3A46活性。