[发明专利]小型猪细胞色素P450重组酶的构建表达及应用

说明书

技术领域

本发明属生物医药领域，特别涉及小型猪细胞色素P450基因的蛋白重组表达及应用。

技术背景

细胞色素P450（cytochrome P450,CYP）是一类含有非共价结合血红素的蛋白，主要位于细胞内质网膜上，在人和动物体内普遍存在。P450酶是人体内重要的药物代谢酶，负责催化内源性物质或外源性物质的Ⅰ相代谢，参与了接近90%左右的临床药物的代谢^[1]。该酶主要存在于肝脏中，在一些肝外组织（如：肺，小肠，肾脏等）中也广泛存在。编码该酶的P450基因是一个基因超家族，含有多个家族和亚家族，其中CYP3A亚家族含量最多，代谢底物谱最广，是人类最主要的药物代谢酶。另外，CYP3A与许多癌症的发生、治疗及预后都密切相关，大大提高了人们对它的关注程度。

新药上市前必须经过临床前动物研究考察药物的安全性和有效性，动物研究能够初步判断药物在体内的药效及药代动力学行为，为药物进行临床试验提供基础数据及重要的参考依据。因此，临床前研究中使用的实验动物需能较好的模拟人体中的情况，才能对后续的人体临床试验产生更好的指导意义。细胞色素P450的差异是实验动物与人药物代谢特性差异的重要原因[2]，其介导的药物代谢对药物的ADME具有重要影响，其介导药物生成代谢产物的种类和转化快慢在很大程度上决定了药物的药代动力学、药效及清除率，决定了药物的有效性和安全性。因此，在药物临床前研究时我们应根据药物性质的不同，尽量选择与人体内ADME代谢特性相似的动物模型。考虑到CYP3A酶在药物代谢中的主导地位，不同实验动物的CYP3A代谢特性就成为动物模型选择的重要依据。

随着动物保护运动的兴起，国际动物保护组织对实验动物的限制更加严格，“3R”原则（Reduce，Replace，Refine）逐渐推广，使得灵长类动物及犬等高等动物使用受到限制，以小型猪进行药物的药理、毒理、药代、药效的研究日渐增多。肝微粒体水平的研究表明小型猪与人CYP酶代谢特性相似，其中猪的CYP3A在催化活性及抑制特性上与人最为接近^[3]。然而肝微粒体为混合酶系，并不能反应小型猪单酶的代谢特性，本研究通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统，能够获得活性良好的小型猪CYP3A家族最主要的单酶CYP3A22和CYP3A46^[4]，为体外研究小型猪与人CYP3A的单酶的相似性，以及体外评价小型猪是否适合用作某药物临床前药代动力学研究的实验动物提供理想的工具。

发明内容

本发明的目的是提供代谢活性良好的小型猪CYP3A22和CYP3A46重组酶的构建表达方法，通过以下步骤实现：

（1）以巴马小型猪的肝cDNA为模板，通过设计CYP3A22和CYP3A46基因的特定引物，获得巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2所示，将该基因片段添A后与pMD18-T连接得pMD18-T/CYP3A22和pMD18-T/CYP3A46质粒，再将其转入大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞进行质粒扩增。

所设计的引物序列如下：

SEQ ID No:3CYP3A22上游引物：ATGGACCTGATCCCAAGCTT

SEQ ID No:4CYP3A22下游引物：TCAGGCTCCACTTACGGTC

SEQ ID No:5CYP3A46上游引物：ATGGACCTGATCCCAGGCTT

SEQ ID No:6CYP3A46下游引物：TCAGGCTCCACTTGTGGTC。

（2）以获得的pMD18-T/CYP3A22和pMD18-T/CYP3A46质粒为模板，通过设计含有BamHI，SAlI两个酶切位点的特定引物，获得两端含特定酶切位点的巴马香猪CYP3A22和CYP3A46基因，用BamHI，SalI两个酶进行双酶切得到CYP3A22、CYP3A46两个基因片段。

引物序列如下：

SEQ ID No:7CYP3A22上游引物：GCGGATCCCGATGGACCTGATCCCAAGCT，

SEQ ID No:8CYP3A22下游引物：

ACGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTCC，