[发明专利]一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法

摘要

本发明公开了一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，包括微囊藻毒素MC-LR的提取、微囊藻毒素MC-LR的富集、分离与纯化、UPLC-MS定性分析和外标法定量分析步骤。本发明方法能对生物体内的微囊藻毒素MC-LR进行定性、定量检测，检测结果可靠，重现性好，灵敏度高，应用该方法能检测虾类等生物体内是否存在累积的MC-LR；本发明方法不仅适用于生物体内微囊藻毒素MC-LR的定性及定量检测，而且能为研究微囊藻毒素在生物体内的累积、传递和代谢解毒以及对水产品进行的安全性评估提供参考；该发明方法操作简单，能节省检测时间和化学试剂。

主权项

1.一种检测生物体内微囊藻毒素MC-LR的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）微囊藻毒素MC-LR的提取：称取冷冻干燥的生物组织样品于研钵中研碎，向研碎后生物组织样品中加入提取液，匀浆，超声破碎，离心，移取上清液至干净容器中避光保存，再加入提取液清洗沉淀，离心后收集上清液，合并所得上清液；所述提取液为EDTA-Na₂的甲酸水溶液，EDTA-Na₂的浓度为0.01～0.05mol/L，甲酸的体积百分比浓度为1%～5%；（2）微囊藻毒素MC-LR的富集、分离与纯化：将步骤（1）中所得的上清液加入已预先活化的HLB固相萃取柱进行富集，先用超纯水淋洗，再用体积百分比浓度为10%的甲醇水溶液淋洗，最后用无水甲醇洗脱，收集洗脱液用氮气吹干，所得固体用甲酸-甲醇-水溶液溶解制成样品待测液，所述甲酸-甲醇-水溶液中，甲酸的体积百分比浓度为1%，甲醇的体积百分比浓度为20%；（3）定性分析：采用UPLC-MS联用方法，根据微囊藻毒素MC-LR标准品的保留时间和特征碎片离子峰的荷质比m/z 进行定性；色谱条件：流动相A为含体积百分比浓度为0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含体积百分比浓度为0.1%甲酸的甲醇溶液；色谱柱：C₁₈柱，100mm×2.1mm，1.8μm；柱温：40℃；进样体积为10μL；流速为0.35mL/min；UPLC梯度洗脱程序见下表：质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子模式扫描，多反应监测（MRM）方式检测；毛细管电压为3.5kV；雾化温度为450℃；雾化作用和喷雾作用均使用氮气，氮气流速分别为850 L/h和50 L/h；质谱分析的条件参数见下表：（4）定量分析：使用外标法，用色谱峰面积定量，用体积百分比浓度为20%的甲醇水溶液配制微囊藻毒素MC-LR标样系列，微囊藻毒素MC-LR浓度范围为0～250ng/mL，在与样品待测液相同的色谱条件下直接进样，以微囊藻毒素MC-LR的浓度为横坐标，相应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，由其回归方程对样品待测液进行定量。