[发明专利]一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法

摘要

一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：选择4-氨基-3,5-二氯苯甲酸作为克伦特罗的半抗原，该分子与克伦特罗分子的同源性大于50%，将该半抗原与载体蛋白进行偶联，得到克伦特罗人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达32000，检测限为1ng/mL，半抑制浓度IC50为10ng/mL。产生的抗体特异性高、灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的克伦特罗残留，具有广阔的应用前景。

主权项

一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，其特征在于以4‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸为半抗原，将4‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸上的羧基通过1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N‑羟基琥珀酰亚胺NHS活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联得到克伦特罗人工抗原，将人工抗原透析，工艺为：（A）将4‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸用N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解，4‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸与N‑羟基琥珀酰亚胺NHS，1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的半抗原溶液；取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N‑二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原；或（B）将4‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸用N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解，4‑氨基‑3,5‑二氯苯甲酸与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，0℃反应1h，得活化的半抗原溶液；取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原。