[发明专利]一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种高特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

盐酸克伦特罗（Clenbuterol），又称“瘦肉精”，是一种平喘药。是肾上腺类神经兴奋剂，20世纪80年代初，美国Cyanamid公司意外发现其有明显的促进生长、提高瘦肉率及减少脂肪的效果，于是其被畜牧业作为瘦肉精使用。但由于其副作用，欧共体于1988年1月1日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用。1991年被FDA禁止。1997年，中华人民共和国农业部下文严禁β-腎上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，盐酸克伦特罗列为第一位，2002年9月10起在中国境内禁止在饲料和动物饮用水中使用盐酸克伦特罗。

目前我国对克伦特罗的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用法(LC/MS)、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器方法是克伦特罗检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。传统的克伦特罗人工抗原一般通过重氮化反应将苯环上的氨基与载体蛋白进行偶联。由于克伦特罗的部分结构与沙丁胺醇的部分结构类似，而且通过重氮化反应后，暴露出的最外端的叔丁基部分正好与沙丁胺醇的结构相同，因此用该抗原免疫产生的抗体不可避免的会对沙丁胺醇产生较高的交叉反应。本发明从克伦特罗分子的另一侧着手，以克伦特罗的类似物4-氨基-3,5-二氯苯甲酸上的羧基为位点与载体蛋白偶联形成了完全抗原。

发明内容

本发明的目的：针对现有克伦特罗抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的克伦特罗人工抗原的合成方法，使得制备高特异性的克伦特罗单克隆抗体成为可能。

本发明提供的克伦特罗人工抗原化合物，具有式I所示分子结构。

（式I）

本发明的技术方案：一种特异性克伦特罗人工抗原的合成方法，以4-氨基-3,5-二氯苯甲酸为半抗原，将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸（4-Amino-3,5-dichlorobenzoic acid，ADBA）上的羧基通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化、或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到克伦特罗人工抗原，将人工抗原透析，然后进行紫外鉴定（图1）。

合成路线为：

工艺为：

（A）将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4-氨基-3,5-二氯苯甲酸与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)的摩尔比为1:1.5:2，在4℃避光搅拌反应1h，再在室温反应12h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，室温反应24h，用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原；

或（B）将4-氨基-3,5-二氯苯甲酸用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4-氨基-3,5-二氯苯甲酸与三正丁胺，氯甲酸异丁酯的摩尔比为1:1.2:1.2，0℃反应1h，得活化的半抗原溶液；

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，牛血清白蛋白用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，0℃预冷30min，其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃条件下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃条件下反应1h，然后室温反应24h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，得到克伦特罗人工抗原。