[发明专利]一种引物中部序列干扰PCR技术

摘要

“一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是采用引物中部序列的一段不互补或同序碱基、引物分子内外反义干扰而竞争性地破坏引物间聚合来选择性抑制引物二聚体(PD)扩增的改良PCR技术。所述引物中部序列干扰是指在常规设计原则优选的引物基础上,选用一对引物中部序列(ID)平行不互补或同序技术、或/和引物加入ID反义修饰寡核苷酸(Oligo)干扰技术、或/和引物分子内ID反义Oligo干扰技术及其组合,仅干扰引物ID而不影响靶特异性扩增,最大程度分散引物对末端少数碱基配对氢键与末端外的碱基氢键合力,而选择性抑制PD,使PCR体系内没有PD累积。辅以矿物油封闭下的引物缓释热启动及UDG预处理消除了PCR体系外产物气雾胶污染,使核酸扩增可靠,实时荧光PCR定量准确。

主权项

1.一种引物中部序列综合干扰PCR方法, 其特征在于：于PCR引物缓释条件下进行靶基因PCR扩增，PCR系统具有以下（a）、（b）和（c）特征，可以在不影响靶基因与引物全长序列的结合及特异性扩增效率的情况下选择性地抑制引物间末端结合及引物二聚体PD非特异性扩增： （a）包括上、下游引物，所述上、下游引物的中部序列碱基不互补; 所述中部序列碱基不互补指中部序列5'‑3'方向平行比对，偏3'端位置即离3'末端4‑5个碱基起倒数5‑9个碱基碱基连续不互补,引物对3'端之间避免2个以上反向互补碱基,引物3'最末端1～2碱基避免之间任何单个反向互补碱基，其末端以碱基C或A结尾；（b）所述上、下游引物，还包括与一条所述引物中部序列互补的反义碱基寡核苷酸；所述反义碱基寡核苷酸片段，具有5‑11个末端封闭的化学修饰反义修饰碱基，其既不能充作PCR模板也不能作为引物,保留了结合功能，能竞争性地结合引物中部序列干扰引物间聚合, 仅引物中部序列的所述反义碱基寡核苷酸干扰不影响引物与靶基因特异性结合及特异性扩增效率, 而选择性地抑制优化引物PCR引物二聚体PD非特异性扩增；（c）所述上、下游引物，采用与引物中部序列互补的反义碱基序列连接于引物5'端前面形成引物分子内3'端含特异性靶结合序列和5'端含反义碱基序列的嵌合引物；所述与引物中部序列互补的反义碱基序列指上游引物和／或下游引物中部序列区5‑7碱基序列的反义链碱基以5'‑3'方向以化学合成方式加在对应的所述上游或下游引物的5'端从而形成嵌合引物，5'端反义碱基序列能反折并与引物自身中部序列结合抑制，能显著减少体系内引物二聚体PD非特异性扩增反应，所述方法为非诊断目的。