[发明专利]一种引物中部序列干扰PCR技术

说明书

“一种引物中部序列干扰PCR技术”，其特征是采用引物中部序列的一段不互补或同序碱基、引物分子内外反义干扰而竞争性地破坏引物间聚合来选择性抑制引物二聚体(PD)扩增的改良PCR技术。所述引物中部序列干扰是指在常规设计原则优选的引物基础上,选用一对引物中部序列(ID)平行不互补或同序技术、或/和引物加入ID反义修饰寡核苷酸(Oligo)干扰技术、或/和引物分子内ID反义Oligo干扰技术及其组合,仅干扰引物ID而不影响靶特异性扩增,最大程度分散引物对末端少数碱基配对氢键与末端外的碱基氢键合力,而选择性抑制PD,使PCR体系内没有PD累积。辅以矿物油封闭下的引物缓释热启动及UDG预处理消除了PCR体系外产物气雾胶污染,使核酸扩增可靠,实时荧光PCR定量准确。

技术领域：

本发明属于分子生物学及分子检验领域的核酸扩增技术领域，具体涉及通过引物对中部序列干扰而竞争性地破坏引物间聚合来选择性抑制PCR非特异性扩增的技术领域。

背景技术：

核酸扩增的思想起源于1971年，发现遗传密码的Khorana曾提出了核酸体外扩增设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”(Kleppe,1971,J.Molec.Biol.,56:341),然而由于当时不具备寡核苷酸合成、耐热聚合酶、热循环仪的条件限制了其发展。直到1983年,美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis在研究核酸测序方法时产生了核酸扩增的灵感:于试管中模拟天然的DNA体内指数式复制过程。其基本原理:提供一种合适的条件---模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间,就可成几何级数地扩增已知两端序列的一段DNA分子。经过一系列探索、发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利（US Patent 4,683,202）。

核酸扩增PCR反应由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：拟扩增的模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：升温至72℃左右，DNA模板--引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原则，按5’-3’方向合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链,不断重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。一般PCR进行30个循环就能将待扩目的基因呈指数扩增放大数百万倍以上,超过30个循环引物二聚体非特异性扩增就极剧增加。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应有时效率达不到理论值。反应初期PCR产物逐渐增加，进入一定循环后靶序列DNA片段的增加呈指数形式即对数期，随着扩增产物的累积及PCR成份的消耗，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，达到“停滞效应”平台期。

随着1985-1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中Taq耐热DNA聚合酶的提取应用以及pfu、Vent、Tth等其它耐热聚合酶的发现应用，PCR技术逐渐成熟、实用，并因其高灵敏度、操作简便而快速传播全世界，因而1989年称为“PCR爆炸年”。PCR技术已成为生命科学领域最重要的核心基础技术,Kary Mullis也因此荣获1993年诺贝尔化学奖。