[发明专利]人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法

摘要

本发明提供一种应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)诱导人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞的方法，所述方法包括以下步骤：hAMSCs分离，hAMSCs原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs细胞免疫表型的检测，hAMSCs诱导分化为神经元样细胞以及细胞免疫荧光染色。本发明的诱导方法应用全反式维甲酸联合bFGF、EGF诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白，实现了间充质细胞跨胚层分化为非间充质细胞的能力，使其有可能成为今后临床应用更为理想的种子细胞。

主权项

一种人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞诱导方法，其特征在于，其应用全反式维甲酸联合bFGF、EGF诱导脐带间充质干细胞分化为神经干细胞，所述方法包括以下步骤：hAMSCs分离，hAMSCs原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs细胞免疫表型的检测，hAMSCs诱导分化为神经元样细胞以及细胞免疫荧光染色；其中，所述的hAMSCs分离的步骤包括：无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D‑Hanks液冲洗，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm3碎块，加入2.5g/L胰蛋白酶37℃消化10分钟；加入含5％小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后用200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1.0g/L II型胶原酶消化液，37℃消化0.5小时；加入含5％小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；在1000转/分钟条件下离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种至25cm2培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10％FBS的DMEM培养基；置37℃、饱和湿度、体积分数5％的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液1次，并摄片记录；待细胞汇合度达80％后，用0.25％胰蛋白酶‑0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37℃消化2‑3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟下离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1×107/ml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液1次，待细胞长满70％瓶底重复以上步骤；所述的hAMSCs的原代培养步骤包括：将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000转/分钟进行15分钟离心，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用0.01M PBS 30mL吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟离心，洗涤2次，收集细胞；接种细胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×106细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动 态观察；培养4‑5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3‑4天半量换液一次；观察细胞贴壁生长至80‑90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶‑0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞；所述的hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括：观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80‑90％汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取10ml0.01M PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入0.25％胰蛋白酶‑0.01％EDTA消化液1.0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察；加入1.0ml FBS中止胰酶消化；加入10ml 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟进行10分钟离心；弃去上清液，加入10ml DMEM/F12重悬细胞，按1∶2‑1∶3比例传代培养；置37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第1代(P1)hAMSCs，待细胞生长至80‑90％汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增；所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括：取培养第2或第3代细胞，首先用0.25％的胰蛋白酶消化后，然后用含1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至1×107/ml；分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD34‑FITC、CD45‑PE、CD19‑FITC、CD29‑FITC、CD44‑PE、CD105‑FITC、CD106‑FITC、HLA‑DR‑FITC，置4℃孵育半小时，PBS洗1次，进行流式细胞仪检测分析；所述的hAMSCs诱导分化为神经元样细胞的步骤包括：取2‑3代培养细胞，分别接种于6孔板，生长密度达到60％时，换成诱导培养基；37℃、5％CO2，饱和湿度静置培养；以及所述的细胞免疫荧光染色步骤包括：培养细胞在诱导分化3天后采用免疫荧光染色。