[发明专利]人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞的诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞诱导方法，特别涉及一种应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞的方法。

背景技术

人羊膜间充质干细胞(human amnion membrane mesenchymal stemcells，hAMSCs)维持了原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，拥有更大的多向分化潜能。hAMSCs理论上可以分化成各种组织细胞，同时因羊膜获得方便且回避了伦理学争议，有潜力成为未来临床应用的干细胞来源之一。但hAMSCs移植后神经细胞转化率在体内仅为3％～10％，而且在体内环境下分化为神经胶质细胞的比率较大而分化为神经元样细胞的比率较小，这无疑会给神经系统功能的恢复带来不利因素。如果能将hAMSCs在体外分化为神经元样细胞，再行细胞移植会有事半功倍的效果。

中胚层来源的骨髓间充质干细胞(BMSCs)向外胚层来源的神经元分化的研究正处于起步阶段。全反式维甲酸是维生素A的衍生物，能够明显增加神经细胞的数量并呈剂量依赖效应，能调节EGF(表皮生长因子)反应的神经干细胞分化，增加神经元细胞和星形胶质细胞的合成。将其与神经营养因子和细胞因子联合用于诱导胚胎干细胞向神经干细胞方向分化，同体内发育过程相似，且可以部分模拟体内环境，因此日益受到重视。但是，这些研究多停留在诱导后hAMSCs具有神经元形态特征和表达神经细胞标记物水平上，而缺乏具有神经细胞生理学特性的证据，因此许多学者认为这类细胞被称为“神经元样细胞”更为妥当。

发明内容

本发明提供一种人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化为神经元样细胞诱导方法，其是应用全反式维甲酸、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子诱导人羊膜间充质干细胞分化为神经元样细胞，不仅具有了神经细胞的典型形态，并表达神经元标志抗原神经元特异性烯醇化酶、星型胶质细胞标志抗原胶质纤维酸性蛋白，所述方法具体包括以下步骤：hAMSCs分离，hAMSCs原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs细胞免疫表型的检测，hAMSCs诱导分化为神经元样细胞以及细胞免疫荧光染色。

其中，所述的hAMSCs分离的步骤包括：无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm³碎块，加入2.5g/L胰蛋白酶37℃消化10分钟；加入含5％小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后用200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1.0g/LII型胶原酶消化液，37℃消化0.5小时；加入含5％小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；在1000转/分钟条件下离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，接种至25cm2培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10％FBS的DMEM培养基；置37℃、饱和湿度、体积分数5％的CO₂培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液1次，并摄片记录；待细胞汇合度达80％后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)溶液于37℃消化2-3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟下离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1×10⁷/ml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液1次，待细胞长满70％瓶底重复以上步骤；