[发明专利]一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法

摘要

本发明提供的一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响；其步骤为试剂配制及样品处置，以电泳及脱色液脱色，确定蛋白大小，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，再进行Western-blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；其检测采用N2气体密封保护，进行液相检测；采用该方法获取的蛋白水解浓度相对标准偏差仅为1.09%，具有很好的重复性和准确性。

主权项

一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，其特征在于：用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响，其步骤如下：步骤1试剂配制：1）0.1M磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 12H2O3 63g,KH2PO40.24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7.2，加超纯水定容至1L，混匀；2）0.01M磷酸盐缓冲液：取0.1M磷酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；3）匀浆缓冲液：1.0M Tris‑HCl 1.Oml，即pH 6.8；10%SDS 6.0ml，β‑巯基乙醇0.2ml，超纯水2.8ml，混匀；4)转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀；5）0.01M磷酸盐缓冲液，即pH7.4：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，加超纯水至1000ml，混匀；6）膜染色液：考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，超纯水118ml，混匀；7）包被液：5%脱脂奶粉1.0g，溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；8）显色液：DAB 6.0mg；0.01M磷酸盐缓冲液10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H202 1.0μl，混匀；9）辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，即为二抗；10）6mol/L盐酸溶液：取0.5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；11）20mM盐酸溶液：取出6.68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；12）Norleucine溶液:取Norleucine粉末6.56mg，以20mM盐酸溶液稀释至1L，混匀；13）氨基酸标准品配制：取4ml Amino Acid Standard H Stock与13.12mgNorleucine粉末，用超纯水定容至100ml，混匀；14）HPLC流动相A：100mL Eluent A浓缩液，加入1L的超纯水，混匀；15）HPLC流动相B：1L的100%Acetonitrile溶液；16）HPLC流动相C：1L的0.1M磷酸氢二钠缓冲液；步骤2样品处理：取high five细胞的猪瘟E2蛋白和健康细胞的上清各1‑1.5ml，同时置于微量离心管中，以3000rPm离心10分钟，吸取上清液进行蛋白质分析；由‑20°C冰箱中取出5倍上样缓冲液，取80μl离心的上清液与 20μl 5倍的蛋白上样缓冲液混合均匀后，于水浴中煮沸15分钟后，置于冰上备用配制12%SDS‑PAGE，将蛋白质分子量标准样品依序上样至胶片中，以电压150V，电泳80分钟后，一片以考马斯亮蓝进行染色，时间30min后，以脱色液脱色，确定蛋白大小；另一片胶片进行蛋白质免疫印记杂交，条件：40mA，时间2小时，使蛋白质转印到醋酸纤维膜上，完成后取出膜放置于塑料洗盒中，加入25ml 5%脱脂乳在室温下进行封闭，时间30min；倒掉脱脂乳，以PBST洗三次后，在PBST中加入一抗WH303，即1:3000，置于4°C冰箱隔夜摇晃感作，倒掉一抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间10min加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗，即1:5000稀释，室温下摇晃感作，时间1h，倒掉二抗，以PBST洗三次后，再以PBST洗五次，每次25ml，每次时间10min在暗室内，将膜放入平皿中，先加1ml去离子水，再加入DAB显色液，即A液和B液各1滴，用移液器反复冲洗膜表面1分钟，在48KD处见到特异性条带，则表示在High five细胞上表达的E2蛋白能被单抗WH303识别，根据Western‑blot确定的条带大小确定E2蛋白的位置，将SDS‑PAGE上的条带切下，用PAGE胶蛋白微量回收试剂盒回收目的蛋白，将回收的目的蛋白再次进行Western‑blot分析，以确定回收的目的蛋白的正确性；其3检测步骤：将回收的猪瘟E2蛋白经离心浓缩仪浓缩至80‑110μL，并抽取10μL浓缩样，加至水解小管中，加6mol/L的HCl 200ul，1‑2mg的固体苯酚，抽真空脱气，采用N2气体密封保护，110℃下反应24小时；反应结束，用离心浓缩仪将水解液旋蒸至干燥状态，加入Norleucine溶液20μL，Borate buffer 60μL，AQC衍生试剂20μL，最终体积100μL，震荡混匀，在55℃温箱中反应10分钟，冷却至室温，进行液相检测；使用Waters的AccQ·TagTM，即Size：3.9x150nm的水解衍生柱，柱温设定37℃，样品槽温度10℃，荧光激发波长设为295nm，输入波长设为395nm，进样量为5μL；其中离心浓缩仪的温度45℃，真空度93.3‑98.6KPa，转速3500rPm。