[发明专利]一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明利用凝胶回收-液相色谱联用方式，对猪瘟E2蛋白进行定量的方法，有效的避免了杂蛋白对定量分析结果的影响。

背景技术

目前对猪瘟病毒的蛋白进行定量的检测方法，有以下几方面：①对蛋白跑胶后的特定条带颜色比对法；②特定波长下的吸光值计算法；③铜离子还原的蛋白定量法；④染料结合的蛋白定量法；其①方法存在人为与试剂差异因素，判定结果最不准确；而后三种方法对样品中所有的蛋白同时进行定量，无法完成针对某一种特殊蛋白的准确定量，换言之，单一的液相色谱难以将这种同源性较接近的蛋白质进行完全分离。

本发明构思使用PAGE胶回收-液相色谱联用方式，对猪瘟E2蛋白进行定量分析，既解决了异种蛋白质分离难，造成结果假阳性的问题，又能很大程度的提高对猪瘟E2蛋白定量检测的准确度和精度。

发明内容

本发明的目的在于：针对猪瘟E2蛋白定量分析，即PAGE胶回收-液相色谱联用方法，替代了传统的比色法，检验效果既准确，又易于操作，有重要的推广价值。

本发明的目的是这样实现的：一种对猪瘟病毒E2蛋白含量的定量检测方法，用PAGE胶进行猪瘟E2蛋白的纯化回收，经液相色谱仪分析，避免了杂蛋白对定量结果的影响，其步骤如下：

步骤1试剂配制：

1）0.1M磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 12H₂O₃ 63g,KH₂PO₄0.24g，溶于900ml超纯水中，用盐酸调pH值至7.2，加超纯水定容至1L，混匀；

2）0.01M磷酸盐缓冲液：取0.1M磷酸盐缓冲液100ml，加超纯水定容至1L，混匀；

3）匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl 1.Oml，即pH 6.8；10%SDS 6.0ml，β-巯基乙醇0.2ml，超纯水2.8ml，混匀；

4)转膜缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加超纯水定容至1000ml，混匀；

5）0.01M磷酸盐缓冲液，即pH7.4：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，加超纯水至1000ml，混匀；

6）膜染色液：考马斯亮兰0.2g，甲醇80ml，乙酸2ml，超纯水118ml，混匀；

7）包被液：5%脱脂奶粉1.0g，溶于200ml的磷酸盐缓冲液中，混匀；

8）显色液：DAB 6.0mg；0.01M磷酸盐缓冲液10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H₂0₂ 1.0μl，混匀；

9）辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，即为二抗；

10）6mo l/L盐酸溶液：取0.5L浓盐酸，加水稀释至1L，混匀；

11）20mM盐酸溶液：取出6.68ml的浓盐酸，以超纯水稀释定容为1L，混匀；

12）Norleucine溶液:取Norleucine粉末6.56mg，以20mM盐酸溶液稀释至1L，混匀；

13）氨基酸标准品配制：取4ml Amino Acid Standard H Stock与13.12mgNorleucine粉末，用超纯水定容至100ml，混匀；

14）HPLC流动相A：100mL Eluent A浓缩液，加入1L的超纯水，混匀；

15）HPLC流动相B：1L的100%Acetonitrile溶液；

16）HPLC流动相C：1L的0.1M磷酸氢二钠缓冲液；