[发明专利]通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法

摘要

通过敲除（yvoA）基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法属于生物工程技术领域。本方法首先以苏云金芽胞杆菌ATCC35646为出发菌株，以温度敏感型载体pKSV7为骨架构建一个基因敲除载体pKSV-ued，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除苏云金芽胞杆菌ATCC35646菌株基因组yvoA基因的方法，构建了一个高产几丁质酶菌株CJ212。经过几丁质酶活测定，确定改良菌株产几丁质酶的能力大大提高。

主权项

一种通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）的方法，其特征在于该方法包括：第1、yvoA基因敲除载体pKSV‑ued的构建第1.1、设计序列表中SEQ ID No.1所示的引物yvoAup‑F和SEQ ID No.2所示的引物yvoAup‑R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；第1.2、设计序列表中SEQ ID No.3所示的引物yvoAdown‑F和SEQ ID No.4所示的引物yvoAdown‑R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游序列，获得1033bp的yvoAdown核酸片断；第1.3、设计序列表中SEQ ID No.5所示的引物erm‑F和SEQ ID No.6所示的引物erm‑R，以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得1197bp的erm基因片断；第1.4、将第1.3步获得的erm基因片断和载体pKSV7用Sal I和Xba I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV‑e载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于‑20℃保存备用；第1.5、yvoAup片断和载体pKSV‑e用Sal I和Hind III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV‑ue载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于‑20℃保存备用；第1.6、将第1.2步获得的yvoAdown片断和第1.5步获得的pKSV‑ue载体用Xba I和Kpn I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV‑ued载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于‑20℃保存备用；第2、CJ 212突变菌株的构建以苏云金芽胞杆菌ATCC35646制备感受态细胞，采用电转化方法，将第1步获得的yvoA基因敲除载体pKSV‑ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，红霉素抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为CJ212；该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了yvoA基因的突变菌株，即为所构建的菌株。