[发明专利]通过敲除基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌的方法

权利要求书

1.一种通过敲除yvoA基因构建高产几丁质酶苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）的方法，其特征在于该方法包括：

第1、yvoA基因敲除载体pKSV-ued的构建

第1.1、设计序列表中SEQ ID No.1所示的引物yvoAup-F和SEQ ID No.2所示的引物yvoAup-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因上游序列，获得1059bp的yvoAup核酸片断；

第1.2、设计序列表中SEQ ID No.3所示的引物yvoAdown-F和SEQ ID No.4所示的引物yvoAdown-R，以苏云金芽胞杆菌ATCC35646基因组DNA为模版PCR扩增yvoA基因下游序列，获得1033bp的yvoAdown核酸片断；

第1.3、设计序列表中SEQ ID No.5所示的引物erm-F和SEQ ID No.6所示的引物erm-R，以pHT315质粒为模版PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得1197bp的erm基因片断；

第1.4、将第1.3步获得的erm基因片断和载体pKSV7用Sal I和Xba I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-e载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

第1.5、yvoAup片断和载体pKSV-e用Sal I和Hind III双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ue载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

第1.6、将第1.2步获得的yvoAdown片断和第1.5步获得的pKSV-ue载体用Xba I和Kpn I双酶切后，用T4DNA连接酶连接，构建pKSV-ued载体，转化大肠杆菌DH5α，提质粒，酶切验证正确后于-20℃保存备用；

第2、CJ 212突变菌株的构建

以苏云金芽胞杆菌ATCC35646制备感受态细胞，采用电转化方法，将第1步获得的yvoA基因敲除载体pKSV-ued转化入苏云金芽胞杆菌ATCC35646，在基因组yvoA位点发生双交换，红霉素抗性平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为CJ212；该菌株的yvoA基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了yvoA基因的突变菌株，即为所构建的菌株。

2.一种权利要求1所述方法构建的高产几丁质酶的苏云金芽胞杆菌CJ212。

3.一种权利要求2所述敲除yvoA基因的苏云金芽胞杆菌菌株CJ212在生产几丁质酶中的应用。