[发明专利]一种小麦遗传转化受体的培养方法及应用

摘要

本发明属于植物组织培养及基因工程技术领域，涉及一种小麦遗传转化受体即分生组织团的培养方法及应用，利用该受体进行遗传转化可快速获得大量转基因植株。对分生组织团进行基因枪轰击，经basta筛选后，对表现抗性的植株进行GUS染色、PCR检测和除草剂抗性检测，确定转基因植株。本发明建立了高效的小麦离体再生及遗传转化体系；解决了目前小麦再生难、遗传转化效率低、稳定性差的问题；与目前常用的小麦幼胚相比，具有取材方便、高频再生的特点，能快速获得大量转基因植株。本发明中的分生组织团也为小麦的生物学研究提供了有效的无性繁殖体系。

主权项

一种利用小麦遗传转化受体即分生组织团培养快速获得再生植株的方法，其特征包含下列步骤：（1）将冬小麦或春小麦的种子灭菌：选取健康、饱满的成熟冬小麦或春小麦种子放入三角瓶中，用75%酒精处理3‑5分钟，无菌水冲洗1‑3次，0.1%升汞溶液处理7‑15分钟，最后用无菌水冲洗3‑5次，在三角瓶中加入无菌水，于25℃条件下浸泡14‑18h，备用；（2）在超净工作台中，用灭过菌的手术刀或解剖针取出冬小麦或春小麦种子成熟胚，接入诱导培养基上培养，一周后保留幼苗基部生长部位，切去伸展的叶片组织和根组织，每15d继代一次；继代时保留膨大基部并切去伸展的叶片组织，培养至30天以后获得外露或被残留叶片包被、表面光滑、呈绿色或浅绿色的细胞组织致密的分生组织团，其直径>5mm，培养至40d~50d为分生组织团产生高峰；前述培养过程中的前15d进行暗培养，之后进行光培养，即每天光照16h，光照强度为2000lux，培养温度为25±2℃；（3）将步骤（2）所得的分生组织团接入分化培养基上培养，至产生丛生芽；（4）将步骤（3）所得的丛生芽分离后接入生根培养基上培养至获得生根苗；（5）依据小麦的类型，将步骤（4）所得的冬小麦生根苗进行春化处理，即在4℃下处理15‑25d，对所获得的春小麦生根苗不进行春化处理；将上述生根苗炼苗后移栽；上述步骤中涉及的培养基组分及配比如下所示：诱导培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.1g/L谷氨酰胺+0.3g/L脯氨酸+0.5g/L水解酪蛋白+2～5mg/L噻二唑苯基脲+0.5～1mg/L 2,4‑D，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；分化培养基：MS基本培养基+15g/L葡萄糖+15g/L麦芽糖+0.5～1mg/L噻二唑苯基脲，琼脂6.5g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8；生根培养基：1/2MS基本培养基+15g/L葡萄糖+0.5～1.5mg/L吲哚丁酸，琼脂4～6g/L；用蒸馏水将上述培养基定容至1L；灭菌前调培养基的pH至5.8。